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高糖诱导肝细胞脂肪变性机制探析 　　【摘 要】目的：探讨高糖诱导肝细胞脂变中的可能机制。方法：分别以18、25mmol/l的葡萄糖浓度培养L02细胞，以11mmol/l葡萄糖浓度培养L02细胞作为对照，测定细胞内甘油三酯（TG）含量反应肝细胞脂变程度；RT-PCR检测乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）、固醇调节元件结合蛋白1c（Sterol regulatory element binding protein 1c ，SREBP-1c）的mRNA表达水平，Western blot分析乙酰辅酶A羧化酶、肝X受体α（liver X receptor alpha ，LXRα）的蛋白表达水平。结果：与对照组比较，高糖可促进L02细胞内甘油三酯含量增加，上调ACC mRNA和ACC蛋白的表达量，而高糖组各时间点SREBP-1c mRNA 和LXRα蛋白表达与对照组比较无明显变化。结论：1、高糖可通过上调ACC的表达，参与肝细胞脂肪沉积的形成过程。2、LXRα- SREBP-1c -ACC途径可能没有参与葡萄糖及其代谢产物诱导的肝细胞脂肪沉积。 【关键词】高糖；肝细胞脂肪变性；乙酰辅酶A羧化酶；肝X受体α；固醇调节元件结合蛋白1c 【中图分类号】R589 【文献标识码】A 【文章编号】1004―7484（2013）09―0022―003 糖尿病和脂肪肝是常见的伴发疾病，在糖尿病患者中，脂肪肝的发病率明显增加，而当前对于这种现象的机制并不十分清楚，因此，研究NAFLD的具体发病机制，制定有效防治措施显得刻不容缓。 目前葡萄糖代谢信号途径在脂肪肝形成中的作用及可能机制引起了广泛的关注，我们既往研究[6]发现碳水化合物反应元件结合蛋白（carbohydrate response element binding protein， ChREBP）在糖和脂肪代谢过程中发挥着重要的作用，调节糖酵解和脂肪酸合成酶基因的表达，但也有学者认为 [4]，过多的葡萄糖可直接作为LXRα的配体，上调LXRα靶基因如SREBP-lc、ACC等的表达，影响肝脏的脂肪沉积。 本实验利用高糖体外培养人正常肝细胞（L02细胞），观察L02细胞的脂肪沉积、LXRα、SREBP-lc、 ACC表达的变化，从正常人肝细胞水平探讨高糖条件下肝脂肪形成的可能机制，为进一步防治脂肪肝提供实验依据。 1 材料和方法 1.1 材料 L02 细胞（重庆医科大学附二院消化内科实验室保存） ；甘油三酯试剂盒（南京建成生物研究所）；ACC、LXRα抗体（美国Santa cruz公司）；β-actin抗体、GAPDH抗体（碧云天生物研究所）； RNA提取试剂盒、PCR试剂盒、RT试剂盒（日本TaKaRa公司）；ACC引物、SREBP-1c引物、β-actin1引物、β-actin2引物（大连宝生物公司）。 1.2方法 1.2.1细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养L02细胞，置入37℃含5%C02孵箱，当细胞贴壁约85%时，用含0.25%胰蛋白酶溶液消化，收集并传代。 1.2.2 实验分组 根据文献研究[3]，实验分为3组：G1组（葡萄糖浓度为11mmol/l，为对照组），G2组（葡萄糖浓度为18mmol/l）和G3组（葡萄糖浓度为25mmol/l）。 1.2.3 TG含量检测 高糖刺激24、48h后收集细胞，按试剂盒说明进行操作，并行细胞蛋白定量，计算每毫克蛋白所对应的TG含量。 1.2.6 ACC 、SREBP-1cmRNA表达的检测 分别在高糖刺激0，3， 6， 12，24，36，48h提取L02细胞总RNA，检测细胞总RNA的纯度和完整性，用RT-PCR方法检测ACC、SREBP-1c基因的mRNA表达量。ACC-1上游引物：5-ACCTGTGGGAGTAGTTGCTG-3，下游引物：5-ATTAGAGGTAGCCCTTCACG-3，扩增片段长度为180bp， β-actin1 上游引物： 5-GGGACCTGACTGACTACCTC-3，下游引物： 5-CGTCATACTCCTGCTTCCTG-3，扩增片段长度为540bp。SREBP-1c上游引物：5-CCCAGAAACTCAAGCGAGAAC-3，下游引物：5-CTTTGCTGTCCTCAAAGACTGG-3，扩增片段长度为274bp；β-actin2 上游引物：5-GACCCAGATCATGTTTGAGACC-3，下游引物：5-ATCTCCTTCTGCATCCTGTCG-3，扩增片段长度为625bp。PCR反应条件为：94℃预变性2min，94℃变性30 s， 53℃退火30 s， 72℃ 延伸30s，共