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痰瘀同治方对小型猪冠状动脉粥样硬化炎症反应影响
痰瘀同治方对小型猪冠状动脉粥样硬化炎症反应影响 [摘要]目的:观察痰瘀同治方对小型猪冠状动脉动脉粥样硬化炎症反应的抑制作用。
方法:将36只中国小型猪随机分为正常对照组,模型组,舒降之组和痰瘀同治方高、中、低剂量组(生药2.0,1.0,0.5 gkg-1),每组6只;除对照组外,其他各组均给予高脂饲料喂养 2周后,采用介入技术球囊损伤冠状动脉左前降支内皮,术后继续高脂饲料喂养8周,制备小型猪冠状动脉粥样硬化模型;术后给药8周,采用血管内超声观察各组动物冠状动脉斑块负荷,进行冠状动脉病理形态学观察,ELISA法测定血清超敏性C反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein, hs-CRP),肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)-α和白介素(interleukin, IL)-6等炎症因子水平。采用免疫组化的方法观察冠状动脉血管壁NF-κB p65核移位的表达。
结果:与对照组比较,模型组动物在实验结束时冠状动脉斑块负荷明显增加(P 2.2分组及给药将36只小型猪随机分为6组(每组6只,雌雄不拘):正常对照组,模型组,舒降之组(0.001 gkg-1),痰瘀同治方高、中、低剂量组(生药2.0,1.0,0.5 gkg-1)。术后第2天每天上午将药物拌于饲料中喂养,连续给药8周。
2.3血清炎症标志物测定各组动物在实验结束(给药后8周)禁食14 h后,锁骨下静脉取血3 mL,1 600×g离心10 min,分离血清,采用ELISA方法测定血清hs-CRP,TNF-α和IL-6水平。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。
2.4冠状动脉血管内超声(IVUS)检测各组动物在实验结束时行左冠状动脉造影后,置入0.014导丝,X线下分别将20-MHz 超声导管沿导丝置入冠状动脉LAD中下部,手动回撤IVUS导管,当有明显的病变出现时,注意观察其严重程度和受累血管的长度。再次进入IVUS导管,进行图像采集和记录。每只血管进行2次采集(Video loop),取影像效果好的进行后期的分析。同时,通过连续X-线透视确定IVUS探头的位置,利用连续的ECG触发IVUS的采集。图像由Volcano invision gold imaging system software自动分析。In-line digital (ILD)二维管腔图由计算机即刻合成显示。采集结束后,依次撤出超声导管和导丝,术中连续心电监护。IVUS数据存储于硬盘,实验完成后进行分析。斑块负荷计算公式:斑块负荷=(斑块面积-管腔面积)/管腔面积×100%。
2.5冠状动脉病理形态观察实验结束后,各组动物颈动脉放血处死,取冠状动脉病变部位血管,10%中性福尔马林溶液固定后,常规石蜡包埋、切片,苏木精和伊红(HE)染色后,观察其形态结构的病理改变。
2.6冠状动脉血管壁NF-κB p65核移位的分析各组动物颈动脉放血处死,冠状动脉放入4%多聚甲醛中固定后石腊切片常规脱蜡至水,每张切片经内源性过氧化物酶灭活,微波抗原修复后,滴加稀释的兔抗人NF-κB p65多克隆抗体(1∶50);37 ℃孵育60 min,随后PBS冲洗3次,并滴加适当稀释(1∶200)的辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG二抗,37 ℃孵育30 min,PBS冲洗后滴加试剂SABC,37 ℃孵育30 min,PBS洗3次进行DAB显色显微镜下观察,在本底较浅且达到适当显色强度时以流水漂洗终止显色反应。最后苏木素复染,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树胶封,光镜下观察。阳性细胞以胞核及(或) 胞质中出现棕黄色颗粒状表达为准,每张切片随机选取6个高倍镜视野(×200),采用Image-Pro plus 6.0图像分析系统,进行光密度分析,记录吸光度。
2.7统计学分析实验结果以±s表示,采用One-Way ANOVA (单因素方差分析)方法,方差齐性应用 Student-Newman-Keuls检验,方差不齐采用Tamhane′s T2检验。P 表2痰瘀同治方对冠状动脉粥样硬化小型猪血管斑块负荷的影响(±s,n=6)
Table 2Effects of TYTZ on the vascular plaque burden in Chinese mini-swine with coronary atherosclerosis (±s,n=6)
组别剂量/gkg-1斑块负荷/%对照-9.36±0.71模型-34.87±1.702)TYTZ0.532.63±4.621.020.22±7.574)2.012.28±0.504)辛伐他汀0.00113.45±1.174)
图2各组小型猪冠状动脉组织形态结构(H
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