分子生物学实验任峰.pptVIP

5.打开电源开关，一般红色为正极黑色为负极，调节电压至3-5V/cm，可见到溴酚蓝条带由负极向正极移动，电泳约30min-60min。 6.在瓷盘中加入适量的水，再加入5－10μl EB，将凝胶放入盘中2－3 分钟 7.将凝胶置于凝胶成像仪内，再紫外灯下检测PCR产物的DNA条带 8.在紫外灯下将pSK-CIPK酶切产生的目的基因带从凝胶上切下来，切下的凝胶块要尽量小； 一、实验原理 通过一定的方法将琼脂糖凝胶上需要的目的DNA带回收下来，用于下游实验。 实验十一 DNA凝胶回收 琼脂糖凝胶电泳片断回收的常用方法 1.柱回收试剂盒 是目前最简单快速的回收方法，只需要将电泳凝胶中的产物条带切下，用溶解Buffer彻底溶解，上包埋有纯化填料的纯化柱，离心，再洗涤一次，离心后用洗脱缓冲液洗脱。全程不过10多分钟，得到的产物溶液可以直接用于后继实验。这个方法几乎不需要什么技巧就能得到稳定的结果，也是目前最多商品化试剂盒选择的方法。但是这个方法不适合用于大片断的回收。 2.低熔点琼脂糖 传统手工操作方法之一，低熔点琼脂糖制备凝胶，电泳后切割目的条带，在TE溶液中65度保温融化，用传统的酚氯仿抽提，乙醇沉淀。这个方法现在用的人已经不多了。 以前经费紧张，低熔点琼脂糖贵，比较经济方法就是常规琼脂糖电泳后，在目的条带前方挖槽，灌入低熔点琼脂糖，凝胶后再电泳一小会儿，等条带进入低熔点琼脂糖区域再切出来，这样就非常节约了。 二、实验目的 1. 从含有目的基因片段凝胶块上回收DNA。 2.回收目的基因片段为下步连接反应作准备 仪器及耗材：天平、台式离心机、微量移液器及吸头、EP管。 材 料： 含有目的基因酶切产物的凝胶块 试 剂： AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 ；无水乙醇； 三、实验仪器、材料和试剂 四、实验步骤 1.在紫外灯下切下含有目的 DNA 的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体并切碎。计算凝胶重量（提前记录 1.5 ml 离心管重量），该重量作为一个凝胶体积（如 100 mg=100 μl 体积）。 2.加入 3个凝胶体积的 Buffer DE-A，混合均匀后于 75oC加热（低熔点琼脂糖凝胶于 40°C加热），间断混合（每 2-3 min），直至凝胶块完全熔化（约 6-8 min）。 3.加 0.5个Buffer DE-A 体积的 Buffer DE-B，混合均匀； 4. 吸取步骤3中的混合液，转移到DNA制备管（置于2 ml（试剂盒内提供）离心管）中，12,000×g 离心 1 min。弃滤液。 5.将制备管置回2 ml离心管，加500 μl Buffer W1，12,000×g 离心30 s，弃滤液。 6.将制备管置回2 ml离心管，加700 μl Buffer W2，12,000×g离心30 s，弃滤液。以同样的方法再用 700 μl Buffer W2洗涤一次12,000×g离心1 min。 7．将制备管置回 2 ml离心管中，12,000×g离心 1 min。 8．将制备管置于洁净的 1.5 ml 离心管(试剂盒内提供)中，在制备膜中央加 25-30 μl Eluent 或去离子水，室温静置 1 min。12,000×g离心 1 min 洗脱 DNA。 重组DNA转化细菌过程示意图 菌落PCR鉴定阳性克隆 并不是所有白斑菌落是含有重组质粒的阳性菌落，存在假阳性现象。可以通过菌落PCR进一步鉴定含有重组质粒的阳性菌落。 常规的PCR鉴定需要进行细菌培养、质粒提取等多步操作后才能进行基因扩增，操作繁琐，耗时较长，为了简化操作程序，Gussow和Clackon提出菌落PCR方法，即用无菌牙签挑取单菌落到TE缓冲液中，煮沸5min，涡旋振荡后短暂离心，用1－2μL裂解液作DNA模板，这样就省去了抽提模板DNA这一步，大大节省了时间和成本。 后来该方法进一步改进，利用牙签直接沾取一点单菌落作为模板进行扩增反应更大量节省了时间，简化了操作程序，单菌落PCR可以有效的筛选阳性重组克隆。 二 实验目的 1. 学习通过蓝白斑筛选阳性重组菌落； 2.学习菌落PCR技术及通过菌落PCR鉴定白斑菌落。 三、实验仪器、材料和试剂 仪器及耗材：培养皿、电热恒温培养箱、无菌工作台、牙签、PCR管、各种tip、PCR仪。 材 料： 连接产物转化后的菌落平板 试 剂： LB 液体培养基 氨苄青霉素(100 mg/mL) 10×PCR 反应缓冲液;