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微生物育种实验内容 [实验一] 用氯化钙制备感受态大肠杆菌 [实验二] 感受态大肠杆菌的转化 [实验三] 用硅胶膜分离法小量提取质粒 [实验四] 质粒的酶切与电泳鉴定 [实验五] 酿酒酵母原生质体制备与观察 [实验六] 酵母染色体DNA的提取 [实验一] 用氯化钙制备感受态大肠杆菌 一 实验目的 （1）掌握用氯化钙制备感受态细胞的原理。 （2）了解并熟练制备感受态细胞的基本方法。 二 实验原理 所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。 将快速生长中的大肠杆菌（对数生长期）置于经低温预处理的低渗氯化钙溶液中，便会造成细胞膨胀（形成原生质球），细胞膜通透性发生变化，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，使细菌处于容易吸收外源DNA的状态。 三 实验材料 LB培养基 ：NaCl 10 g/L, Trypton 10g/L, Yeast Extract 5 g/L 氯化钙溶液 0.1mol/L: 取无水氯化钙11.1 g溶液1 L水中(4 ℃保藏) 以上试剂均0.08 mPa，灭菌20 min 37℃回转式恒温调速摇瓶柜 恒温水浴锅（两台，分别为37℃、42℃） 台式高速离心机 四 实验步骤 (1)挑取大肠杆菌JM109新鲜单菌落一个于装有15 ml液体LB培养基的100 mL三角瓶中，37℃振荡培养至OD值为0.3～0.4，将装有菌液的三角瓶放入冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却。 (2)取预冷的1.5 mL离心管若干个，用无菌枪头将菌液分装到离心管中，每管装菌液1.5 mL。 (3)离心管迅速放入冰水中，静止30分钟。 (4)8,000r/m 离心30 s，离心后将离心管迅速放入冰水中静置2 min，弃尽上清液。加入预冷的氯化钙溶液约400 mL，轻轻吹吸悬浮菌体，于冰水中放置20 min。 (5)重复实验步骤(4)两次。 (6)8,000 r/m离心30 s，迅速放回冰水中，静置2 min。弃尽上清，加入预冷的氯化钙溶液100 mL，轻轻吹吸悬浮菌体，菌悬液迅速放回冰水中。 所获菌悬液即为感受态细胞，可立即用于转化，也可在4 ℃放置12～24 h这样可获得更高的转化率。采用这一方法要获得较高的转化率的关键是保持低温，即菌液离开冰水的时间要尽量短。 五 结果与讨论 [实验二] 感受态大肠杆菌的转化 一 实验目的 （1）掌握基因工程中质粒转化的原理； （2）学会操作转化实验的方法和技巧。 二 实验原理 转化（transformation）是某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型的细胞的DNA而使它的基因型和表型发生相应变化的现象。质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。 本实验是以重组质粒pUC19作为外源DNA，因pUC19携带氨苄青霉素抗性基因，当用pUC19转化时，转化子具有新的氨苄青霉素抗性基因遗传性状，在含有一定浓度的氨苄青霉素平板上，受体细胞不能生长，而只有转化子才能生长繁殖。 三 实验材料 重组质粒pUC19，本实验室构建。 四 实验步骤 ①取感受态细胞一管，在冰水中放置10 min ②加入待转化的质粒0.5 μL，轻轻混匀，在冰水中放置30 min。 ③将管子放入42 ℃水浴中，准确计时90 s，迅速取出放回冰水中，静止5 min。 ④加入液体LB培养基800 μL，轻轻混合，37 ℃水浴45 min。 ⑤将菌液适当稀释后涂布含相应抗菌素(Amp)的固体LB平板，37℃培养培养12～18h后即可见菌落。 菌落分离后用于实验三，质粒提取。 五 结果与讨论 [实验三] 用硅胶膜分离法小量提取质粒 一 实验目的 掌握用硅胶膜分离法小量提取质粒的原理及操作方法。 二 实验原理 在含强阴离子洗涤剂的碱性溶液中细胞破裂而染色体和蛋白质变性，并和破裂的细胞壁互相缠绕成大型复合物，分子量较小的质粒DNA和RNA释放到上清液中，前者被被十二烷基硫酸盐包盖。当用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效的沉淀下来。 用SDS和强碱处理细胞是使质粒和染色体分离的关键步骤，硅胶具有一特殊的性质，即在高离子强度的溶液中可以与核酸专一性的结合，而在离子强度降低后又能与所结合的核酸分离。质粒提取试剂盒就是根据这一原理实现质粒的快速纯化。 三 实验材料 3.1质粒提取试剂 质粒提取试剂盒 溶液I、溶液II、溶液III、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液 3.2提取质粒电泳实验材料及仪器 50×T