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环境微生物实验 环境科学与工程学院 实验一培养基的制备  　培养基是用人工的办法将多种营养物质按微生物生长代谢的需要配制成的一种营养基质。培养基中均应含有满足微生物生长发育且比例合适的水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素以及某些特需的微量元素外还应具有适宜的酸碱度〔pH值〕、缓冲能力、氧化还原电位和渗透压。 一、实验目的 学习和掌握配制培养基的一般方法和步骤 二、实验器材 (1)药品和试剂：牛肉膏、蛋白陈、NaCl、10％NaOH溶液、l0％盐酸溶液。可溶性淀粉、K2HPO4、MgSO4·7H2O、KNO3、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、10％NaOH溶液、10％盐酸。 (2)器材：小烧杯、小铝锅、天平、牛角匙、1000mL刻度烧杯、玻棒、pH试纸、试管、分装漏斗、棉花。 三、方法与步骤 1、牛肉膏蛋白胨培养基的配制 (1)培养基配方： 牛肉膏5.0g 蛋白胨10.0g、NaCl5.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH7.0。 (2)操作步骤： 1）称药品 按实际用量计算后，按配方称取各种药品放入大烧杯中。牛肉膏可放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶解后倒入大烧杯；也可放在称量纸上称量，随后放人热水中，牛肉膏便与称量纸分离，立即取出纸片。蛋白胨极易吸潮，故称量时要迅速。 2）加热溶解 在烧杯中加入少于所需要的水量，小火加热，并用玻棒搅拌，待药品完全溶解后再补充水分至所需量。若配制固体培养基，则将称好的琼脂放入已溶解的药品中，再加热融化，此过程中．需不断搅拌，以防琼脂糊底或溢出，最后补足所失的水分。 3）调pH 检测培养基的pH，若pH偏酸，可滴加1滴1mol?L-1NaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸检测，直至达到所需pH范围。若偏碱，则用1mol?L-1HCl进行调节。pH的调节通常放在加琼脂之前。应注意pH值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。 4）过滤 液体培养基可用滤纸过滤，固体培养基可用4层纱布趁热过滤，以利结果的观察。但是供一般使用的培养基，该步可省略。 5）分装 披实验要求，可将配制的培养基分装入试管或三角瓶内。分装时可用漏斗以免使培养基沾在管口或瓶口上面造成污染(见图4－1)。 分装量：固体培养基约为试管高度的1／5，灭菌后制成斜面（图4－2）。分装入三角瓶内以不超过其容积的一半为宜。半固体培养基以试管高度的1/3为宜．灭菌后垂直待凝。 6）加棉塞 试管口和三角瓶口塞上用普通棉花(非脱脂棉)制作的棉塞，棉塞制作方法如图4—3。棉塞的形状、大小和松紧度要合适，四周紧贴管壁，不留缝隙，才能起到防止杂菌侵入和有利通气的作用。要使棉塞总长约3／5塞入试管口或瓶口内，以防棉塞脱落。有些微生物需要更好的通气，则可用8层纱布制成通气塞。有时也可用试管帽或塑料塞代替棉塞。 7）包扎 加塞后，将三角瓶的棉塞外包一层牛皮纸，以防灭菌时冷凝水沾湿棉塞。 8）培养基的灭菌时间和温度，需按照各种培养基的规定进行，以保证灭菌效果和不损培养基的必要成份。培养基经灭菌后，必须放37℃温室培养24h，无菌生长者方可使用。 图 例 2、高氏一号培养基的制备 (1)培养基配方：可溶性淀粉20g、KNO3 1.0g、K2HPO4 0.5g、MgSO4·7H2O 0.5g、NaCl 0.5g、FeSO4·7H2O 0.01g、琼脂 20g、蒸馏水1000mL、pH 7.2~7.4。 (2)操作步骤： 1）称量和溶解 先计算后称量，按用量先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少量冷水将其调成糊状，再加少于所需水量的沸水中，继续加热，边加热边搅拌，至其完全溶解。再加入其他成分依次溶解。对微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100mL水中加入1g的FeSO4·7H2O，配成浓度为0.01g?L-1的贮备液，再在1000mL培养基中加入以上贮备液1mL即可。待所有药品完全溶解后．补充水分到所需的总体积。如要配制固体培养基，其琼脂溶解过程同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 2）pH调节、分装、包扎、灭菌及无菌检查同牛肉膏蛋白胨培养基配制。 3．常用的真菌培养基配方 （1）马铃薯培养基：用以分离培养霉菌、酵母菌 马铃薯(去皮) 200g 葡萄糖(或蔗糖) 20g 琼脂 20g 水 1000mL pH自然 121℃灭菌30min 上述培养基中加入1％的酵母粉或蛋白胨，则能促进孢子的大量增加。 （2）蔗糖硝酸钠培养基（察氏培养基）：适合于鉴定多数霉菌