核酸的定量测定.pptVIP

二、实验原理 在酸性环境中，定磷试剂中的钼酸铵以钼酸形式与样品中的磷酸反应生成磷钼酸，当有还原剂存在时磷钼酸立即转变蓝色的还原产物——钼蓝。 2. 钼蓝最大的光吸收在650—660nm波长处。当使用维生素C为还原剂时，测定的最适范围为1-10微克无机磷。 测定样品核酸总磷量，需先将它用硫酸或过氯酸消化成无机磷再行测定。总磷量减去未消化样品中测得的无机磷量，即得核酸含磷量。 RNA的理论含磷量为9.5%，故由所测的核酸含磷量可计算出核酸含量。 消化的RNA溶液(0.06mg/mL) ： 取0.6mg酵母RNA，加入1.5M H2SO4溶液10mL，在沸水浴中加热10-20分钟，使核酸充分水解后，用于对各组分的鉴定。 未消化的RNA溶液(0.06mg/mL) : 取0.6mg酵母RNA,加入蒸馏水10mL，55-65度消化半小时。 三、 实验步骤 1. 取同样规格的试管8支，按下表顺序分别精确地加入各试剂。 将试管内溶液立即摇匀，于45℃恒温水浴内保温30-45分钟。取出冷却至室温，于660nm处测定OD(光密度)值。 以1-6号管标准磷含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。 二苯胺法 二、实验原理 脱氧核糖核酸中的2-脱氧核糖在酸性环境中与二苯胺试剂一起加热产生蓝色反应，在595nm处有最大吸收。DNA在40-400微克范围内，光密度与DNA的浓度成正比。 在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。除DNA外，脱氧木糖，阿拉伯糖（五碳糖）也有同样反应。其它多数糖类，包括核糖在内，一般无此反应。 三、 实验步骤 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精确地加入各试剂。 将试管内溶液立即摇匀，于70℃恒温水浴内保温50-60分钟。取出冷却至室温，于595nm处测定OD值。 以1-6号管DNA含量（微克）为横坐标，光密度为纵坐标，绘出标准曲线。 根据7号管测得的OD值，从标准曲线求出DNA待测液中的DNA含量。 地衣酚法 二、实验原理 当RNA与浓盐酸共热时，即发生降解，形成的核糖转变成醛类，后者与3，5-二羟基甲苯（地衣酚）反应，在Fe3+或Cu2+催化下，生成鲜绿色复合物。反应产物在670nm处有最大光吸收。 RNA浓度在20—250μg/ml范围内，光吸收与RNA浓度成正比。 地衣酚法特异性差，凡戊糖均有此反应，DNA和其他杂质也能与地衣酚反应产生类似颜色。 三、 实验步骤 1. 取同样规格的试管7支，按下表顺序分别精确地加入各试剂。 将试管内溶液立即摇匀，置沸水浴内25-30分钟。取出冷却至室温，于670nm处测定OD值。 以0-5号管RNA浓度为横坐标，对应光密度为纵坐标，绘出标准曲线。 根据6号管测得的OD值，从标准曲线求出RNA待测液浓度。 核酸的定量测定 紫外吸收法 核酸的凝胶电泳 定磷法 二苯胺法 地衣酚法 紫外吸收法?实验原理 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性质，其吸收高峰在260nm波长处。核酸的摩尔消光系数（或称吸收系数）用来表示。为每升溶液中含有1克原子核酸磷的光吸收值（即A值）（表）。测得未知浓度核酸溶液的A260nm值，即可以计算出其中RNA或DNA的含量。该法操作简便，迅速，并对被测样品无损，用量也少。 试剂和器材 试剂： 钼酸铵－过氯酸沉淀剂：取3.6mL 70%过氯酸和0.25g钼酸铵溶于96.4mL蒸馏水中，即成0.25%钼酸铵－2.5%过氯酸溶液。 5-6%氨水：用25-30%氨水稀释5倍。 材料 酵母RNA干粉。 1.准确称取待测核酸样品0.5g，加少量0.01mol/L NaOH调成糊状,再加适量水，用5-6%氨水调至pH7.0，定容至50mL。 2.取两支离心管，甲管加入2mL样品溶液和2mL蒸馏水，乙管加入2mL样品溶液和2mL沉淀剂。混匀，在冰浴上放置30min。 3.在3000r/min下离心10min。从甲、乙两管中分别吸取0.5 mL上清液，用蒸馏水定容至50mL。选择厚度为1cm的石英比色杯，在260nm波长处测定A值。 4.测定A280的值。求出A260/A280.判断RNA的纯度。 RNA=A260/A280=2.0 操作方法 二、计算公式 ΔA260 RNA浓度 = x N 0.024 x L 式中， ΔA260为甲管稀释液在260nm波长处A值减去乙管稀释液在260nm波长处A值；