二氧化钛结合超滤膜富集和分离肿瘤患者唾液中的磷酸化肽和唾液酸化糖肽.docxVIP

Vol． 35高等学校化学学报 No． 102014 年 10 月CHEMICAL JOUＲNAL OF CHINESE UNIVEＲSITIES2073 ～ 2077doi: 10． 7503 / cjc氧化钛结合超滤膜富集和分离肿瘤患者 唾液中的磷酸化肽和唾液酸化糖肽李娟，姜武辉# ，徐晓颖( 大连医科大学附属第二医院，大连 116023)摘要 利用 TiO2 富集、超滤膜滤过实现了选择性富集和分离磷酸化肽和含唾液酸的 N-链接糖肽． 首先选取 截留分子量为 1 × 104 的超滤膜分离糖肽和磷酸化肽，然后利用酪蛋白和牛血清白蛋白的酶解物验证所建立 的方法，该方法的最低检出限是 0. 16 pmol． 将上述方法应用于肺癌患者的唾液检测，成功检测并鉴定到 8 个磷酸化肽和 5 个糖肽． 本方法可有效提高磷酸化肽和糖肽检测的选择性和灵敏度，为疾病生物标志物的 检测提供了新方法．关键词 二氧化钛; 富集; 超滤膜; 磷酸化肽; 糖肽 中图分类号 O657. 7文献标志码 A22蛋白质糖基化和磷酸化是两种最基本、最普遍，也是最重要的翻译后修饰方式，在信号转导、免 疫应答和细胞分化等方面起调控作用［1］． 肿瘤的发生、发展和转移与异常的蛋白质糖基化和磷酸化关 系密切［2 ～ 4］． 在复杂体系中，糖蛋白和磷酸化蛋白的化学计量表达低，酶解后糖肽和磷酸化肽的丰度 特别低，需要富集后才能进行生物质谱分析． 目前，糖肽的富集方法主要包括凝集素亲和色谱法［5］、 硼酸亲和色谱法［6，7］和金属氧化物亲和色谱法［8，9］． 磷酸化肽的富集方法主要有固定金属离子亲和色 谱法［10，11］和金属氧化亲和色谱法［9，12，13］． 这些富集方法中只有以 TiO 为代表的金属氧化物亲和色谱法 可以实现糖肽和磷酸化肽的同时富集［9，14］． TiO 共富集后糖肽和磷酸化肽的进一步分离将有益于两种 翻译后修饰肽的鉴定． 文献［15］采用 TiO2 结合亲水作用色谱( HILIC) 法富集和分离了糖肽和磷酸化 肽，但是由于磷酸化肽和去糖链后的糖肽在 HILIC 上亲水性差异小，导致磷酸化肽和去糖链糖肽共同 流出，降低了两者的富集、分离选择性． 在规模化蛋白质组学中，被广泛应用的胰蛋白酶酶解产生肽 段的分子量为 1 × 103 ～ 2. 5 × 103 ． 末端含有唾液酸的高度分支的 N-链接糖肽通常含有 10 ～ 25 个单糖 单位，糖链的分子量在 1. 6 × 103 ～ 4 × 103 之间，糖肽的分子量比相应非糖肽平均高 2. 8 × 103 ． 利用糖 肽与相应非糖肽的质量差异可实现糖肽的初步富集［16］． 我们曾结合超滤膜去除血清中的大量高丰度［17］蛋白和 DNA、ＲNA 等大分子量干扰化合物，然后利用 TiO2 富集超滤膜滤过液中的磷酸化肽． 本研究选取样品来源广、取材简便且无创的唾液为研究样品，采用 TiO2 同时富集肿瘤患者唾液中的糖肽和 磷酸化肽，进一步采用超滤膜分离糖肽和磷酸化肽． 该方法能实现磷酸化肽和糖肽的选择性富集和分 离，为探讨肿瘤发病机制及发现肿瘤标记物奠定了方法学基础．1 实验部分1． 1 试剂与仪器TiO2 ( 粒径 5 mm) 购自日本 GL Sciences 公司; 胎球蛋白( Fetuin) 、α-酪蛋白( Casein) 、二硫叔糖醇 ( DTT) 、牛血清白蛋白( BSA) 、碘乙酸( IAA) 、三氟乙酸( TFA) 、乳酸( LA) 和 NH4 HCO3 购自美国 Sig- ma Aldrich 公司; 二磷酸化肽委托上海强耀生物科技有限公司合成． 测序级胰蛋白酶购自美国 Promega收稿日期: 2014-07-16． 网络出版日期: 2014-09-30．基金项目: 国家自然科学基金( 批准号: 资助．联系人简介: 徐晓颖，女，副主任医师，主要从事肿瘤生物标记物研究． E-mail: xiaoyingxu73@ aliyun． com# 姜武辉现工作单位为营口瑞丰环保服务有限公司．2074高等学校化学学报Vol． 35公司; 超纯水由美国 Millipore 公司 Mill-Q 纯水机系统制备; 10% ( 体积分数) 氨水溶液购自瑞士 Fluka公司; 甲酸( FA) 购自 Acros 公司; 乙腈( ACN) 购自 Merck 公司．3K 和 10K 超滤膜购于美国 Millipore 公司( 截留分子量分别为 3. 0 × 103 和 1 × 104 ); 脱盐用 GE- Loader 凝胶吸头购自 Eppendorf 公司; 脱盐用 C18 材料购自 Sunchrom 公司． 纳升级电喷雾-四级杆-飞 行时间质谱( nano ESI Q-TO