凝胶迁移实验.docx

凝胶迁移实验（EMSA）凝胶迁移或电泳迁移率实验（EMSA-electrophoretic mobility shift assay）是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术，可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白，目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。实验步骤：探针的标记→探针的纯化→EMSA胶的配制→EMSA结合反应→电泳分析一、探针的标记1.设置探针标记的反应体系；2.使用水浴或PCR仪，37℃反应10分钟；3.加入1微升探针标记终止液，混匀，终止探针标记反应。4.再加入89微升TE，混匀。此时可以取少量探针用于检测标记的效率。通常标记的效率在30%以上，即总放射性的30%以上标 记到了探针上。为实验简便起见，通常不必测定探针的标记效率。5.标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在-20℃。二、 探针的纯化1.对于100微升标记好的探针，加入1/4体积即25微升的5 M醋酸铵，再加入2体积即200微升的无水乙醇，混匀。2.在-70℃至-80℃沉淀1小时，或在-20℃沉淀过夜。3.在4℃，12 000 g-16 000 g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉。4.在4℃，12 000 g-16 000 g离心1分钟。小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。5.加入100微升TE，完全溶解沉淀。标记好的探针最好立即使用，最长使用时间一般不宜超过3天。标记好的探针可以保存在 -20℃。三、EMSA 胶的配制1.准备好倒胶的模具。可以使用常规的灌制蛋白电泳胶的模具，或其它适当的模具。最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。为得到更好的结果，可以选择可灌制较大 EMSA 胶的模具。2.按照如下配方配制20毫升4％的聚丙烯酰胺凝胶(注意：使用29:1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大)。3.按照上述次序加入各个溶液，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。避免产生气泡， 并加上梳齿。如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。四、EMSA结合反应1. 如下设置EMSA结合反应阴性对照反应： （1）Nuclease-Free Water ：7微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 0微升。（4）标记好的探针 ：1微升。（5）总体积 ：10微升。样品反应：（1）Nuclease-Free Water ：5微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）标记好的探针： 1微升。（5）总体积： 10微升。探针冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子： 2微升。（4）未标记的探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）总体积 ：10微升。突变探针的冷竞争反应：（1）Nuclease-Free Water ：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子 ：2微升。（4）未标记的突变探针： 1微升。（5）标记好的探针： 1微升。（6）体积 ：10微升Super-shift反应：（1）Nuclease-Free Water：4微升。（2）EMSA/Gel-Shift结合缓冲液(5X) ：2微升。（3）细胞核蛋白或纯化的转录因子：2微升。（4）目的蛋白特异抗体 ：1微升。（5）标记好的探针：1微升。（6）总体积 ：10微升。2. 按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温(20-25℃)放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。然后加入标记好的探针，混匀，室温(20-25℃)放置20分钟。 3. 加入1微升EMSA/Gel-Shift上样缓冲液(无色，10X)，混匀后立即上样。注意：有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建 议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至能观察到蓝颜色即可。五、 电泳分析 1.用0.5XTBE作为电泳液。按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X 的EMSA上样缓冲液(蓝色)，以观察电压是否正常进行。 2.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。在多余的某个上样孔内加入10微升稀释好的1