提取组织RNA,反转录,qPCR流程图.doc

一、Total RNA的提取： 取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，10min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1ml Trizol，充分匀浆。（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。） 室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中 加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管； 加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min 弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。重复三次 弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ul DEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。 附：1OD260=40μg/ml 用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。（可无） 可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。证明RNA完整无降解。 二、反转录： 说明书：10 μl 反应体系可最大使用 500 ng 的 Total RNAμg（以前用的40，下次用20） 20ul的体系：先把buffer和RNase Free dH20和enzyme 配成mix 5×PrimeScript Buffer（ for Real Timeμl PrimeScript RT Enzyme Mix I ：1μl Oligo dT Primer（ 50 μM）μl Random 6 mers（ 100 μM）μl 总RNA ：1μl(1μg/μl) RNase Free dH2O ：12μl 反转录反应条件如下:37 15 min （反转录反应）85 5 sec（反转录酶的失活反应）4avoid freeze-thaw cycles） 三、内参检测 β-actin 50μl体系 试剂 使用量 10*taq buffer 5μl dNTP 4μl Primer-F（100μM） 0.5μl Primer-R（100μM） 0.5μl Taq E 0.25μl 模板500 ng 1μl 灭菌蒸馏水 加至50μl PCR 反应条件扩增 1 kb 的 DNA 片段的 PCR 反应条件如下：98℃ 10 sec.55℃ 30 sec.（下次60℃，去掉非特异性）72℃ 30 s（对于80bp的内参来说是不是可以省去） 72℃ 5min. 4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。 四、定量PCR 电泳检测，条件同上。增大至50个循环。 五、分析数据 引物 AT1F: GCCCTTCGGCAATCACCTAT AT1R: TGAGACACGTGAGCAGGAAC AT2F: CCTGGCAAGCATCTTATGTAGTTC AT2R: CCGGAAATAAAATGTTGGCAAT ACTIN FGCAGATGTGGATCAGCAAGC R GGCGGACTGTTACTGAGCT