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生物技术大实验 实验指导 （植物基因工程方向） 张 汉 尧 编写 西南林学院生物技术教研室 二00五年十月 生物技术大实验规则 生物技术大实验是教学的重要环节,是培养学生动手能力的必要措施。为确保实验的顺利进行。以下规则，请大家共同遵守。 不得无故迟到、缺席、早退。 保持安静，精心操作，认真实习。 讲究卫生，严禁吸烟，药品废物不乱丢乱倒。 注意节约，不随意浪费药品及试材。 爱护公物，使用仪器，用前检查，用后归还，用完的玻璃器皿应及时清洗。 六、 注意安全。使用电器要特别小心谨慎；离开实验室要关好水电门窗。 目录 前言 1 1实验目的 1 2实验内容 1 3实验流程 2 4材料 3 4.1仪器与用品 3 4.2 试剂 3 4.3 材料 6 4.3.1 菌株和质粒 6 4.3.2 植物材料 6 4.3.3 生化试剂与寡核苷酸引物 6 4.3.4 引物 6 4.4步骤与方法 7 4.4.1 拟南芥叶片组织培养 7 4.4.1.1 培养基的配制 7 4.4.1.2接种 7 4.4.2大肠杆菌感受态的制备及转化 8 4.4.3质粒的小量提取 9 4.4.4质粒的酶切检测 10 4.4.5 土壤根癌杆菌感受态的制备（CaCl2）及转化 10 4.4.6 PCR挑选转化子 11 4.4.7 琼脂糖凝胶电泳检测 12 4.4.8 菌种保存 13 4.4.9 叶盘法转化拟南芥 13 4.4.10植物DNA的小量提取 14 4.4.11 转基因植物的PCR检测 15 5 作业 17 前言 在迄今发展起来的转基因技术中，农杆菌介导的遗传转化占据主导地位，应用最为广泛，特别是在双子叶植物上尤其普遍。近几年来农杆菌转化在水稻等谷类作物上取得成功，其应用范围将进一步扩大。农杆菌介导的优点是转化频率高，可转移较大的DNA片段，所转移DNA很明确地为T-DNA左右边界之间的序列，并可直接用不同的植物组织进行基因转移，不需要原生质体培养再生植株的技术，从而提高转育周期。 拟南芥是一种十字花科植物，广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其原因主要基于这种植物具有以下特点： （1）形态个体小，高度只有3Ocm左右； 2）生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右； 3）种子多，每株每代可产生数千粒种子； 4）形态特征简单； 5）基因组小，只有5对染色体。PCR挑选转化子； 植物基因组DNA提取。 PCR检测。 3、实验流程： 表达载体的构建（用基因工程操作中所得的结果） 转化大肠农杆菌（DH/5α） 提取质粒酶切检测 转化根癌农杆菌(LBA4404) 拟南芥培养 PCR检测 取外植体 转化拟南芥外植体 组织培养 获得再生植株 提取植物DNA PCR检测 4材料 4.1仪器与用品 冷冻高速离心机、恒温摇床、低温冰箱、超净工作台、电泳仪、PCR仪、鼓风干燥箱、高压湿热灭菌锅、电光分析天平（感量为0.0001g）、杂交仪、PH计、移液枪、枪头（200ul、ml、5ml1.5ml离心管、500ml三角瓶、量筒（20ml、50ml、100ml）、牙签、培养皿、烧杯（50ml、100ml、500ml）、容量瓶、三角瓶、镊子、手术刀、药勺、玻璃棒、透气封口膜、橡皮圈、酒精灯。 4.2 试剂 1、Cell Lysis Solution ： 0.2mol/L NaOH 1% SDS 2、Cell Resuspension Solution ： 50mmol/L Tris-HCl ( PH=7.5 ) 10mmol/L EDTA 100ug/ml RNase 3、Neutraliztion Solution ： 1.32mol/L NaAc ( PH=4.8 ) LB液体培养基 ： 蛋白胨 10g/L 酵母浸膏 5g/L NaCl 10g/L 5、YEB液体培养基 ：