艾比湖湿地土壤纤维素降解菌筛选及酶活测定.docVIP

艾比湖湿地土壤纤维素降解菌筛选及酶活测定 　　摘要：筛选了采自新疆艾比湖湿地的土壤中的纤维素降解菌，并测定了其中具有较高降解效率的8株菌的纤维素酶活。结果表明：经过初筛分离纯化后，共得到纤维素降解菌74株菌，属26个种，筛到的厚壁菌门Firmicutes 芽孢杆菌属Bacillus 细菌最多，有14个种，菌株13C12（Bacillus aquimaris）的纤维素酶活最高，滤纸酶（FPase）活为21.4 U/mL，内切葡聚糖酶酶活达37.4 U/mL，外切葡聚糖酶（Avicelase）为19.2 U/mL，β-葡萄糖苷酶酶活为24.6 U/mL，Bacillus aquimaris可尝试作为工业产酶菌株进行后续试验。 　　关键词：艾比湖；纤维素降解菌；酶活；Bacillus aquimaris菌株 　　中图分类号：S182 　　文献标识码：A 文章编号2017 　　1 引言 　　新疆艾比湖湿地国家级自然保护区是中国内陆荒漠物种最为丰富的区域之一，由于其特殊的地理位置，使得该地形成了沼泽、滩涂、盐湖、沙漠、石漠、砾漠、盐漠等多种土壤类型。依此而生的土壤微生物资源经历了长期的进化演变，成为我国干旱区重要的种质基因库，具有典型性和较高的保护价值[1]。纤维素是地球上最丰富的碳质资源之一，由于难以被大量分解利用，而被人们大量堆积或燃烧，从而对环境造成极大的污染和资源浪费。如果能通过纤维素水解酶转化利用，必将产生很好的经济和社会效益[2]。纤维素酶是由一系列酶系组成，滤纸是纯纤维素材料，其聚合度和结晶度都比较适中，降解滤纸的滤纸酶（FPase）活性所代表的是纤维素酶的总活力，体现了纤维素酶系内的协同能力。滤纸酶活力的测定主要依据纤维素酶水解滤纸产生还原糖的数量[3]。研究中试图通过分离和筛选具有较高纤维素酶活性的菌株，为开发具有应用前景的工业菌种做出贡献。 　　2 材料与方法 　　2.1 供试土壤 　　试验土壤采自新疆北部艾比湖湿地国家级自然保护区内的芦苇地和红柳地。采取距表层0～20 cm土壤约200 g，去除土壤中可见的动植物残体和石子，用自封袋封装带回实验室，过2 mm筛，立即进行筛菌测酶活。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 纤维素降解菌筛选 　　称取1.0 g 土样到10 mL离心管中，加入无菌水9.0 mL 和几粒无菌钢珠，经高速振荡混匀后静置，取上清液1 mL稀释至10-3、10-4、10-5、10-6、10-7五个浓度梯度。取100 μL涂布于培养基上，30℃ 恒温倒置培养24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落，接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。 　　另取上清液1 mL加入液体培养基中，恒温摇床120转/min，30℃富集三代后，划线接种在固体培养基上，24 h后，用牙签挑取形态有差异的单菌落（产外切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶的菌落有透明水解圈，产β-葡萄糖苷酶的菌落周围有黑圈），接种到固体平板培养基上，用于纯化后测序鉴定。 　　注意：液体培养基不加显色剂和琼脂。 　　2.2.2 纤维素酶活测定 　　（1）滤纸酶（FPase）。取100±0.5 mg滤纸与1 mL菌液于10 mL比色管中，加入pH值为4.8，0.1 mol/L的乙酸-乙酸钠缓冲液l mL，50℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。 　　（2）内切β-1.4-葡聚糖酶（CMCase）。取2 mL CMC-Na溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。 　　（3）外切β-1.4-葡聚糖酶（Avicelase）。取2 mL微晶纤维素溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温。 　　（4）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）。取2 mL水杨苷溶液与1 mL菌液于10 mL比色管中，50 ℃水浴酶解反应1 h后取出，迅速冷却至室温[4]。 　　酶促反应结束之后，立即加入0.8 mL DNS 试剂，沸水浴5 min之后取出，迅速冷却至室温，用水定容10 mL。在530 nm波长处测定吸光度OD 值，对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖量P。以高温灭活的粗酶液为对照组。 　　葡萄糖标准曲线绘制：取10 mL比色管6支，加入1.0 mg/mL的葡萄糖标准溶液0.0、0.16、0.32、0.48、0.64、0.8 mL，加蒸馏水0.8、0.64、0.48、0.32、0.16、0.0 mL，加DNS试剂0.8 mL，混匀后煮沸5 min，取出立即用冷水冷却，用水定容至10 mL，摇匀，530 nm测吸光度OD值，以OD值为纵坐标，葡萄糖的含量为横坐标，绘制标准曲线。 　　酶活定义