大肠杆菌ATP生产基因的系统性全基因组扫描.ppt

一. 背景介绍 二. 材料与方法 三. 结果与分析 四. 讨论 大肠杆菌ATP生产基因 的系统性全基因组扫描 一. 背景介绍 作为各种生物反应的能量来源，ATP在所有的活性生物中都扮演着重要的角色。 背景二 背景一 背景三 谷胱甘肽有解毒,抗衰老,保护肝脏,提高免疫力,美容等作用,是一种用途广泛的活性短肽，需要ATP参与合成。 对大肠杆菌的全部基因组，包括ATP调控基因在内的具体功能研究越来越深入。 1. 菌种 用选择性卡那霉素抗性基因替换大肠杆菌K-12 (BW25113)中的每一个非必需基因。 二. 材料与方法 ： 含2.8%葡萄糖的LB培养基（LBG），30?°C，培养24小时至稳定期。 菌株 　的构建 ： 培养 　条件： 2．细胞ATP合成活性的检测 二. 材料与方法 步骤2：测OD24h 离心洗涤收集测ODsus 与预处理液混合20min 步骤3: 检测溶液与去污剂混合 混合液A与混合液B混合反应 步骤4： 测发光量 步骤1：菌体培养 混合液A 混合液B 图1. 细胞ATP合成活性的高通量检测技术 二. 材料与方法 二. 材料与方法 3．谷胱甘肽合成活动的检测 菌株转化 菌种培养 离心收集 洗涤 与GLT混合反应 悬浮于GT 中 热失活 取样 定量测量 三. 结果分析 图2. ATP合成活性 图2. ATP合成活性与相关OD24h 插图:OD24h 1．ATP合成活性的讨论 三. 结果分析 图２.ATP合成活性 插图. OD24h 变化范围 2%—445% 15%—169% 标准差 24% 9% 平均值 104% 93% 中间值 104% 94% 高于100%的菌株数 37% 1% 低于90%的菌株数 24% 30% 2． ATP生产基因的分类、鉴定、聚类分析 三. 结果分析 (1). 影响ATP生产的缺失基因的分类 表１ 基因分类 编码阻遏物的多于激活子 16/72 比例高 活性最高的3% 活性最低的3% (2) 影响ATP合成的缺失基因的鉴定 三. 结果分析 inc gene name ATP activity (%) OD24?h (%) COG code Description 表２． inc　基因信息 三. 结果分析 表3． dec　基因信息 inc gene name ATP activity (%) OD24?h (%) COG code Description 三. 结果分析 图３.基因的ATP合成活性与OD24h (3) 基因的聚类分析 高OD24h值 的dec基因 低OD24h值 的dec基因 高OD24h值 的inc基因 低OD24h值 的inc基因 inc dec 3．选择ΔptsG菌株合成谷胱甘肽 三. 结果分析 高于２倍 约为1.7倍 1．稳定期细胞浓度 　我们检测了6种生长非常缓慢的F1-ATP酶菌株(ΔatpA, C, D, F, G, 和 H)，它们在16小时间达到完全生长。 由于并没有检测所有的菌株是否到达稳定期，可能有些菌株未完全生长。 四.讨论 　　即使如此，这些菌株的ATP合成活性也肯定高于菌株到达完全生长时的活性，因为生长期的活性要高于稳定期的活性。 1．稳定期细胞浓度 增加细胞浓度的基因数目远大于降低作用的数目 四.讨论 实验显示单基因缺失能引起细胞浓度的降低。 　当303种生长必需基因缺失加入到3960种被测菌株中时，这个倾向会更为显著。 通过单基因缺失提高大肠杆菌的细胞浓度是很困难的。 2．ATP生产基因的保守性 大约有2600个基因在所有的被检测的23种大肠杆菌菌种中出现 . 实验中,21个inc 基因和20个 dec 基因除了ydcQ只在13个菌种中出现外，其余基因在所有被检测23个菌种中出现。 ATP生产基因对大肠杆菌菌种的发展十分重要。 四.讨论 非常高的保守性 3. “Keio Collection” 功能筛选的潜在影响 1 检测菌株对95种碳源的利用 2比较所有非必需基因缺失菌株的生长速率 3对大肠杆菌K-12的群游活动进行分析 4甘油基本培养基的条件必需基因组的鉴定 四.讨论 以上这些运用“Keio Collection”的系统性全基因组分析鉴定了一些大肠杆菌K-12在不同条件下的基因功能。将来，如果在同样条件下，这些分析有可能展现基因功能和组织途径的多层面信息，以及用表型将基因分组。 结合这些运用通透细胞检测的多重分析，将能设计出一种全基因组