载体处理流程.docVIP

PET28菌液从-70℃取出 超净台于LB 卡娜板上划线，用枪头挑取一点即可 过夜培养，37℃平板倒置 挑取单菌落于5mlLB卡纳液体培养基中培养 培养条件：37℃,220r/min,12-16h 质粒提取（根据试剂盒进行操作要求） 双酶切，HindII和Nhe I，酶切体系如下：（冰盒上操作） 质粒 Buffer(ul) HindII(ul) Nhe I(ul) ddH2O ≦1ug 5 1 1 50 to total 根据浓度计算体积 酶切后37℃过夜培养，为了酶切更彻底。一般一个小时就可以。 PCR 后跑电泳进行浓度检测 PCR 条件设定 预变性 变性 退火 延伸 保存 94℃ 94℃ 61℃ 68℃ 10℃ 94℃ 94℃ 61℃ 68℃ 10℃ 2min 15s 30s 6min 59；59 02 05 30cycle 胶回收 （10*Buffer点样） 再次PCR ,加入KOD-plus酶 酶切和纯化后PET28 PCR 50ul体系 10*PCR Buffer for KOD-Plus ddH2O (ul） 2mMdNTPS (ul） 25mmol/L MgSO4 (ul） F-Primier (ul） R-Primier (ul） PET-28 (ul） KOD-plus (ul） 5 33 5 2 1.5 1.5 1 1 检测后