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聚合酶链反应 Polymerase Chain Reaction 拟探讨的主要内容 基本概念 PCR的基本原理 PCR引物设计的原则 PCR 模板的制备 PCR反应条件的控制及注意事项 PCR技术的主要类型 PCR技术的应用 基本概念 聚合酶链反应　PCR 　　模仿生物体内DNA复制的一种特异性的DNA片段的体外酶促合成（扩增）方法。具体而言， PCR是在模板ＤＮＡ和四种三磷酸脱氧核糖核苷酸底物存在的一定缓冲体系中，由ＤＮＡ聚合酶催化一对引物间特异ＤＮＡ片段的合成过程。 特点: 特异性、高效率、和忠实性。 　 PCR的基本原理 PCR反应体系 缓冲液 模板 引物 底物dNTP TaqDNA聚合酶 Mg2+ PCR的基本原理 变性 denature 加热至90-96℃,双链模板 氢键变成单链。 退火 annealing 当温度突然降低至45-65℃, 引物与其互补的单链DNA模 板在局部形成杂交链。 延伸 extension　70-74℃下，在Taq DNA 聚合 酶和四种脱氧核糖核苷三磷酸底 物及Mg2+存在的条件下引物沿着模 板DNA延伸。 三个步骤构成的循环重复进行　 PCR产物的累积规律 PCR反应中，DNA扩增遵循酶促反应动力学的原则。反应初期目的DNA片段的增加呈指数增长，随着DNA产物的逐渐积累，酶的催化反应趋于饱和，此时DNA扩增产物的增加减慢，进入相对稳定状态，称为“平台期”，达到平台期所需要的PCR循环次数取决于样品模板的量。 反转录PCR的原理 反转录PCR reverse transcription RT-PCR 以RNA为起始模板产生cDNA, 再以cDNA为模 板进行PCR扩增。 逆转录反应在42℃进行，随后将反应混合物加 热至95 ℃5分钟灭活逆转录酶。然后进行PCR 扩增。 逆转录酶： MMLV 鼠白血病病毒中提取 AMV 禽成髓细胞瘤病毒中提取 PCR引物设计 引物 ： 正义引物（上游引物） ：与正义链序列一致 PCR引物设计的原则 引物长度 15-30bp 引物的3，末端碱基与模板一定要配对 5，末端碱基 无严格的限制，可以被修饰 GC的合理含量 45-55% Tm=4（G+C）+2（A+T） 避免引物自身不应存在互补序列 两个引物之间不应存在互补序列 引物中的碱基组尽可能随机分布 引物的DNA序列不应与非扩增区域有同源性 模板的制备 PCR反应的模板可以是DNA也可以是RNA。 核酸提取的原则 保证核酸一级结构的完整性 排除其他分子的污染 核酸提取的主要步骤； 破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质及多糖、脂 类等生物大分子 去除其他不需要的核酸分子 沉淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 PCR反应条件的控制 PCR反应的缓冲液 提供PCR反应合适的酸碱度和某些离子。 Mg离子浓度 0.2-2.5mmol/L TaqDNA聚合酶的活性依赖镁离子 底物浓度 20-200umol/L TaqDNA聚合酶 0.5-5U/100ul 反应温度 变性温度和时间 退火温度和时间 退火温度决定PCR反应的特异性 延伸温度和时间 PCR实验中的注意事项 防止污染 隔离不同操作区 严格实验操作 样品制备要严格按无菌操作原则进行。 设立对照 阳性对照 阴性对照 试剂对照 PCR结果 PCR技术的主要类型 Nested-primer PCR 先用一对外侧引物扩增含目的基因的大片段，再用内侧引物以大片段为模板扩增获取目的基因. PCR技术的主要类型 multiple PCR 在一次反应中加入多对引物，同时扩增一份样品中不同序列的PCR过程。 PCR技术的主要类型 Asymmetric PCR 两条引物使用不同的浓度，在PCR 反应的前25个循环中主要生成双连DNA产物，在低浓度引物被耗尽时，高浓度引物介导的PCR反应会产生大量的单链DNA。 PCR技术的主要类型