猪髓样分化因子myd88特异性shrna干扰载体的构建筛选及干扰效果.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１５，３５（７）：１７ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ 檪檪檪檪檪檪檪檪殏 檪 殏 檪 研究报告檪 殏 檪 殏檪檪檪檪檪檪檪檪 猪髓样分化因子ＭｙＤ８８特异性ｓｈＲＮＡ干扰载体的 构建筛选及干扰效果评价 宗　鑫　胡汪洋　汪以真 （浙江大学饲料科学研究所　农业部动物营养与饲料重点开放实验室　浙江省饲料及动物营养重点实验室　杭州　３１００２９） 摘要　髓样分化因子ＭｙＤ８８（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ８８）信号通路是一个具有多种调节功能 的传导通路，在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用。构建猪（Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ）ＭｙＤ８８基因的ｓｈＲＮＡ干扰载体，并在转录水平和蛋白质表达水平对其干扰效果进行验证， 以筛选出干扰效果最优的干扰载体。根据猪ＭｙＤ８８基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号：ＫＣ７６６４２４．１）全长 ｃＤＮＡ序列，利用Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司在线设计软件设计出４对ｓｈＲＮＡ干扰序列，退火成双链后，分别 将其插入到ｐＹｒ１．１载体中，构建ＭｙＤ８８基因的ｓｈＲＮＡ真核表达载体 ｐＹｒ１．１ｐｉｇＭｙＤ８８ｓｈ１、 ｐＹｒ１．１ｐｉｇＭｙＤ８８ｓｈ２、ｐＹｒ１．１ｐｉｇＭｙＤ８８ｓｈ３、ｐＹｒ１．１ｐｉｇＭｙＤ８８ｓｈ４，并通过双酶切和测序对其 进行鉴定。构建成功后转染猪肺泡巨噬细胞３Ｄ４／２，通过 ＲｅａｌｔｉｍｅＰＣＲ及 Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ验证 ＭｙＤ８８基因的表达水平，以及对ＬＰＳ刺激后炎症因子ＴＮＦ基因表达水平的影响。结果表明，所 α 构建的猪ＭｙＤ８８基因的特异性ｓｈＲＮＡ表达载体均可显著降低猪ＭｙＤ８８ｍＲＮＡ和蛋白质的表达 水平（Ｐ＜０．０５），干扰效率分别达到３６％、６７％、６０％、６９％；相比于未干扰组，ＬＰＳ刺激ＭｙＤ８８沉 默之后的巨噬细胞，炎症因子ＴＮＦ基因表达水平显著下降（Ｐ＜０．０５），表明所构建猪ＭｙＤ８８干 α 扰载体干扰效果较好。 关键词　猪　髓样分化因子ＭｙＤ８８　载体构建　干扰效果 中图分类号　Ｑ７８２ ［５］ 　　髓样分化因子ＭｙＤ８８（ｍｙｅｌｏｉｄｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ 疫和调节获得性免疫过程中起着重要作用 ，其信号 ８８）基因主要在免疫细胞中表达，如单核细胞、胸腺细 通路的激活通过一类桥接于受体与蛋白激酶之间的接 ［１］ 头蛋白来传导。ＭｙＤ８８作为其中的一种重要的接头蛋 胞、Ｔ细胞、Ｂ细胞、辅助性细胞、巨噬细胞中 ，是激活 先天性免疫反应的基本受体，在哺乳动物的先天性免 白，在ＴＬＲ激活后首先被招募，通过与ＴＩＲ家族胞内的 ［２］ ＴＩＲ结构域相互作用，介导下游信号的转导，在ＴＬＲ信 疫反应中发挥重要作用 ，最早发现于髓样细胞的分 ［６７］ 化，由２９６个氨基酸残基组成，是第 １个被发现的接头 号通路中起着关键作用 。 ［３］ 　　研究表明，ＭｙＤ８８依赖通路在维持肠道稳态，甚至 蛋白分子，主要存在于信号转导通路下游 ，具有２个 ［８］ 特殊的结构域，即Ｎ端的死亡结构