基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的ELISA抗体检测方法的建立与.PDFVIP

微生物学通报 Dec. 20, 2017, 44(12): 2830−2838 Microbiology China /wswxtbcn tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.170510 研究报告 基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的 ELISA 抗体检测方法的建立与评价 * 杨浩 方六荣 董楠 刘静 钱瑾 刘寒 王荡 肖少波 (华中农业大学动物医学院 农业微生物学国家重点实验室 湖北 武汉 430070) 摘 要：【目的】猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus ，PDCoV)是近年来新发现的一种猪 肠道冠状病毒，2014 年首次暴发于美国，随后亚洲多个国家也相继报道，对养猪业构成了巨大 威胁。以大肠杆菌表达纯化的PDCoV 重组核衣壳(N)蛋白为包被抗原，建立检测PDCoV 抗体的 间接 ELISA 方法，为 PDCoV 的血清抗体检测和流行病学调查提供工具。【方法】以PDCoV CHN-HN-2014 株的基因组 RNA 为模板，通过RT-PCR 扩增PDCoV 核衣壳蛋白(N)基因的全长 cDNA ，将其插入原核表达载体 pET-30a 中，构建原核表达质粒 pET30a-N ，转化大肠杆菌 Rosetta(DE3) ，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside ，IPTG)诱导表 达，以纯化的重组N 蛋白为包被抗原，建立PDCoV N-ELISA 抗体检测方法，评估其特异性、敏 感性、稳定性，并用于临床血清的检测。【结果】SDS电泳检测证实表达的重组N 蛋白主 要以可溶性形式存在，Western blotting 证实表达的重组蛋白具有反应活性。用纯化的重组蛋白建 立的N-ELISA 具有良好的特异性、敏感性、稳定性。与中和试验同时检测 148 份免疫猪血清和 102 份临床血清，两种方法的阳性符合率为88.99%，阴性符合率为92.90% ，总符合率为91.20%。 用建立的ELISA 方法检测267 份临床血清，PDCoV 抗体阳性血清的比率为66.67%。【结论】建 立的猪德尔塔冠状病毒N-ELISA 抗体检测方法与中和试验的符合率高，可用于PDCoV 血清抗体 检测和流行病学调查。 关键词：猪德尔塔冠状病毒，核衣壳蛋白，间接ELISA ，中和试验 Foundation item: Key Technologies Research Development Program of China (No. 2015BAD12B02); National Key Research Development Program of China (No. 2016YFD0500103) *Corresponding author: Tel: 86-27 E-mail: fanglr@ Received: July 08, 2017; Accepted: November 02, 2017; Published online () : November 09, 2017 基金项目：国家科技支撑计划项目(No. 2015BAD12B02) ，国家重点研发计划项目(No. 2016YFD0500103) *通讯作者：Tel ：86-27；E-mail ：fanglr@ 收稿日期：2017-07-08 ；接受日期：2017-11-02 ；优先数字出版日期() ：2017-11-09 杨浩等: 基于猪德尔塔冠状病毒重组核衣壳蛋白的 ELISA 抗体检测方法的建立与评价