李明远断病手迹（七十九）鉴定菊花菌核病.docVIP

李明远断病手迹（七十九）鉴定菊花菌核病 　　2017年3月15日上午，我去了一趟位于北京市顺义区的某菊花基地，查看越冬菊花的生长情况。 　　此时种植在日光温室里观赏大菊的母株一般都长出30 cm左右的脚芽，每个品种一般有4株。由于每株都长出了许多脚芽，看上去绿油油的一片。但是，仔细观察可以发现也有少数长的不大好的母株，这些母株除了新发出的脚芽小而黄外，还有些死株。对我来讲更关注的是那些死了的脚芽（图1），应当搞清它们死的原因。 　　一开始我拔了1枝藏在脚芽中的枯枝，发现仅在茎基的几个叶片为黄褐色，上面的叶子多呈青枯状，像是近期突然枯死的病株。从茎部看基部呈灰褐色至褐色（图2），表面还有些发湿，似乎有些霉状物；用手捏捏有些发软，折断后，可看到茎部中空，里面还有一些白色的菌丝（图3）。看来有可能是一种真菌病害。我将它装入塑料袋中后继续调查，结果在一个大约7分地（约466.7 m2）的日光温室里，发现了8株类似的病株。这8株发病的程度不同，之前那株是发病最轻的。多数病株往往有多个脚芽同时发病；少数病株发芽后因老根腐烂，造成整株枯死；埋在土中的病部，有时上面还覆盖着一些白霉（图4）。可惜的是我没有查看那些没有发芽就死掉的植株，有可能也属于这类病害。所以这种病害，发生的相当严重。 　　这到底是什么病害呢？据我所知，可在根及茎部长出白霉的植物病害较多，例如根腐病、疫病、菌核病等，因此仅从当前的症状，还不能确定到底是什么病害，需要回到实验室通过试验与分析才能做出结论。 　　回到实验室的那天下午，我将大部分病样存入冰箱里，取出少量的病样先用诱发疫病的方法，将病组织接种在消毒的黄瓜上保湿。4天后并没有反应，因此排除疫病的可能。当我从冰箱里取出病株再次观察时，发现有的病样长出了许多白霉（图5）。在这么低的温度下，还能生长的真菌不多，有可能是菌核病所致。但是此时没有见到有菌核长出，仍然不好作结论。 　　因为我此前曾研究过菌核病，知道将菌核病菌放在PDA培养基上培养一段时间，就会在菌落的边缘产生出许多菌核。有了菌核就可证明这里发生的就是菌核病。如果再通过人工接种，证明它可以侵染菊花，那就肯定是菊花菌核病。 　　分离病原菌比较常用的方法有2种，一是组织分离法，即在无菌的条件下，切取带有病原的组织块，放在培养基上，让它生长；二是在无菌的条件下，从病组织上挑取病原。因为我们保存在冰箱里的病枝上见到了白霉，所以我决定从病组织上挑取病原。这样做比较省事儿，但是也有风险。就是容易被细菌污染，使分离工作失败。需要使用酸性培养基会抑制细菌的生长，于是我在6 cm直径的PDA培养基上加了1滴25%灭过菌的乳酸，用涂布玻棒摊平后，挑入菊花茎部长出的白霉，在25℃的培养箱中培养。3天后有新的菌丝长出，但是非常稀疏，我又将其转回不加入酸的PDA平板上。这时它长的很快，长出的菌落有?c发灰，第4天就在皿边长出了菌核，证明了它是菌核病（图6）。 　　为了证明它的侵染性，我使用了离体叶法对菊花进行了人工接种。接种使用的寄主是一种夏菊，分别采下它的嫩芽和叶片，在芽的基部斜削一刀，造成一个较大的斜面；再准备3个底部衬有3张滤纸的直径为9 cm的消毒培养皿，将芽和叶置入其中，加入少许无菌水后，再从培养菌核病菌的PDA平板上挑两块带菌的基物，贴在病叶及嫩芽的切面上。用未贴病菌而贴脱脂棉的作对照。3天后接种的芽的茎部腐烂，变为灰褐色，上面有许多菌丝；接种叶的叶柄也腐烂，变成了灰褐色，同时病菌还扩展到叶片的基部，使其变为灰褐色。第5天接种的嫩芽上长出了菌核（图7），而对照毫无变化（图8），由此证明了病菌对菊花的侵染性。 　　与此同时，我们利用分子病理学的手段对该菌种进行了验证。利用通用引物ITS1/ITS4对病菌ITS序列进行了扩增，扩增产物纯化后送到“上海生工”测序，序列经NCBI BLAST比对，与已报道的Sclerotinia sclerotiorum的ITS序列一致性最高，达到100%（NCBI登录号：FJ810516）。进一步利用MEGA 4.0软件，Neighbor joining方法构建了基于ITS序列的Sclerotinia属菌种的进化树（图9），结果待试菌种与S. sclerotiorum紧密聚合，表明该病原菌为S. sclerotiorum。 　　这时我还发现保存在2℃冰箱里从田间采回的病秧子上也长出了菌核。从几个方面证明了我们3月15日在那个菊花基地采到的死秧就是菊花菌核病[Sclerotinia sclerotiorum（Lib.）de Bary]。 　　实际上我们对菊花菌核病并不陌生，记得近几年我在温室里拍摄大菊的花朵时就见过零星的病株。当时发病的部位主要是在花上，造成花瓣腐烂，同时还生出大量的白霉，在霉层里往往夹杂着黑色的菌核（图10）。但当