高效液相色谱 金叶.ppt

荧光检测器 凡具有荧光的物质，在一定条件下，其发射光的荧光强度与物质的浓度成正比 只适用于具有荧光的有机化合物（如多环芳烃、氨基酸、胺类、维生素和某些蛋白质等）的测定 柱前或柱后衍生 其灵敏度很高（检测下限为10-12～10-14g／ml） 痕量分析和梯度洗脱样品的检测均可采用 * UV-VIS DAD Flu Refra(示差) Elec Conduc other Ms? 检测器使用统计 HPLC的分类 根据分离机制不同分为: 1、液固吸附色谱法（LSC） (liquid-solid adsorption chromatography) 2、液液分配色谱法（LLC） (liquid-liquid partition chromatography, chemical bonded phase chromatography ) 3、离子交换色谱法（IEC） ( ion-exchange chromatography) 4、亲和色谱（Affinity Chromatography; AC） *  其他色谱类型： 空间排阻色谱法（ steric exclusion chromatography ，SEC） 手性色谱法（Chiral Chromatography；CC） 胶束色谱法（Micellar Chromatography；MC） 电色谱法（Electrochromatography；EC） * 一、液—固吸附色谱法 固定相：固体吸附剂（如硅胶、氧化铝等，粒度5～10μm） 流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂 基本原理：溶质分子占据固定相表面吸附活性中心(极性基团)能力的差异；分离过程是一个吸附-解吸附的平衡过程。液固色谱实质是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分离的。 * 1．分离原理 当流动相通过固定相（吸附剂）时，吸附剂表面的活性中心就要吸附流动相分子。同时，当试样分子（X）被流动相带入柱内，只要它们在固定相有一定程度的保留就要取代数目相当的已被吸附的流动相溶剂分用）于是，在固定相表面发生竞争吸附: X + nSad = Xad + nS 达平衡时,有 其中Kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强，难于洗脱。Kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分据此得以分离。Kad值可通过吸附等温线数据求出。 2．固定相 液－固吸附色谱所用固定相多是一些吸附活性强弱不等的吸附剂，如硅胶、氧化铝等。由于硅胶的优点较多，如线性容量较高，机械性能好，不溶胀，与大多数试样不发生化学反应等，因此，以硅胶用得最多。 3.流动相 一般把吸附色谱中流动相称作洗脱剂。在吸附色谱中对极性大的试样往往采用极性强的洗脱剂；对极性弱的试样宜用极性弱的洗脱剂。 二、液—液分配色谱法 固定相与流动相：均为液体（互不相溶），其中固定相是将特殊的液态物质涂于或化学键合于载体表面。 基本原理：根据被分离组分在固定相和流动相中溶解度不同而分离，分离过程是一个分配平衡过程 * 1.固定相 液液色谱的固定相由载体和固定液组成。 （1）常用的载体有：全多孔型载体：由硅胶、硅藻土等材料制成；表面多孔型载体（薄壳型微珠载体）。 固定液：不同聚合度的聚乙二醇、甲酰胺、亚丙基二醇等 （2）化学键合固定相：它是将各种不同有机基团通过化学反应键合到载体表面的一种方法。 它代替了固定液的机械涂渍，因此它的产生对液相色谱法迅速发展起着重大作用，可以认为它的出现是液相色谱法的一个重大突破。它是目前应用最广泛的一种固定相。 据统计，约有3/4以上的分离问题是在化学键合固定相上进行的。 2．流动相 根据所使用的流动相和固定相的极性程度，将其分为正相分配色谱和反相分配色谱。 正相分配色谱：流动相的极性小于固定相的极性， 它适用于极性化合物的分离。其 流出顺序是极性小的先流出，极 性大的后流出。 反相分配色谱：流动相的极性大于固定相的极性， 它适用于非极性化合物的分离， 其流出顺序与正相色谱恰好相反 优点：色谱柱再生方便，样品负载量大，重现性好，分离效果好等 缺点：尽管流动相与固