2、病毒之过滤与浓缩-卫生福利部疾病管制署.doc

計畫編號： DOH102-DC-2602 行政院衛生署疾病管制局102年度科技研究發展計畫 腸病毒71型疫苗之開發- 建立C4腸病毒71型疫苗產程和免疫效價之檢測(II) 研 究 報 告 執行機構：行政院衛生署疾病管制局血清疫苗研製中心 計畫主持人：江正榮 研究人員：陳奕安、張靜如、莊傑閔、鍾瑋 執行期間：102年1月1日至102年12月31日 目錄 目錄 …… ………………………………………………………………2 中文摘要 3 英文摘要 5 前言 …………………………………………………………………….7 材料與方法 12 一、 細胞和病毒的培養 12 二、 病毒之過濾與濃縮 13 三、 病毒之純化 13 四、 純化後病毒之檢驗 14 五、 病毒的不活化 15 六、 疫苗效價的測定 15 結果 …………………………………………………………………...17 一、 利用50L Tidecell 010潮汐式生物反應器培養EV71 C4病毒過程中，各個產程參數最適化之探討： 17 二、 六批50L TideCell010產程之過濾、濃縮及純化之分析比較 21 三、 小鼠及兔子動物試驗與血清中和抗體效價分析 24 討論 …………………………………………………………………...26 圖表 … ………………………………………………………………..30 參考文獻 48 期末報告審查意見回覆………………………………………………..52 中文摘要TideCell生物反應器搭配BioNOC II微載體生產平台，以無外源蛋白(血清及胰蛋白酶)系統產製腸病毒71型C4 genogroup之原型疫苗。另為評估TideCell生物反應器搭配無血清產製原型疫苗之可行性，進一步探討因生物反應器、濃縮、純化以及檢驗平台的不同，造成對原型疫苗產製效率的影響，以求達到最適化條件。 延續去年初步建立50L TideCell010病毒試量產平台及純化經驗，今年進一步測試攻毒換液、潮汐速率、潮汐滯留時間、延長管柱層析體積、超高速離心純化、更新ELISA多株抗體等條件，完成六批50 L TideCell010生物反應器原型疫苗試製，50 L生物反應器產製之病毒抗原量最高為ELISA 22.59 OD/ml、TCID50 6.6 log；管柱層析純化與超高速離心純化回收率達25%、93%；原型疫苗經過福馬林不活化後接種小鼠，血清抗體中和效價最高可達到1:79。 今年度50 L TideCell010共6次疫苗試製產程中，單位體積ELISA OD值及TCID50值均穩定；管柱層析純化方面能有效分離EV71及移除宿主蛋白，並於線性放大後改善回收區間過窄之問題；超高速離心可分離出兩種EV71病毒顆粒，經由西方墨點法確認病毒顆粒組成不同，分別進行免疫小鼠實驗，結果顯示兩者抗原性相當。儘管50L TideCell010產程順利擴增並維持穩定，但嘗試諸多調整卻仍未掌握提升50L TideCell010產程效果之關鍵，未來將朝向篩選多種EV71疫苗株，與開發具有分辨抗原免疫性之能力的檢驗平台目標前進。 關鍵字：腸病毒71型原型疫苗、C4 genogroup、TideCell生物反應器、 BioNOC II微載體英文摘要 tangential flow ultrafiltration, purification, and diagnostic platform on the efficacy of our vaccine production model. First, the growth of vero cells and E36 virus yield were tested under serum free medium and varying inoculation and cultivation temperatures, using the same roller bottle virus production and purification platform as last year. Results comparable to last year were achieved under 37℃. After testing the viability of vero cell growth on BioNOCII fiber, six batches of 50L TideCell prototype vaccine with the best ELISA value of 22.59 OD/ml and TCID50 6.6 log were completed. These results were comparable to thos