3 四川大学《基因工程》第三章-操作原理.pdf

第三章 基因操作的主要技术原理 1 第一节 核酸的分离与纯化  核酸包括DNA、RNA两种分子，在细胞中都 是以与蛋白质结合的方式存在的  真核生物95%DNA存在于细胞核内，5%在细 胞器  75%的RNA存在于细胞质，10%在核内，15% 在细胞器  rRNA （80～85% ），tRNA及核内小分子RNA （10～15%），mRNA （1～5%） 2 一、核酸分离提取的原则 1. 保证核酸一级结构的完整性 2. 排除其它分子的污染  核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的 有机溶剂和过高浓度的金属离子  将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂 类分子的污染降到最低  排除其它核酸分子的污染 3 核酸提取的基本要求  尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减 少各种有害因素对核酸的破坏  减少化学因素对核酸的降解（过酸、过碱）  减少物理因素对核酸的降解（机械剪切力、 高温）  防止核酸的生物降解 4 提取核酸的一般程序: 破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质 及多糖等 去除其它核酸分子 沉 淀核酸，去除盐类、有机溶剂等杂质 纯化核酸 核酸的质量评估（电泳、 D260/OD280 、酶切） 5 二、质粒载体的分离与纯化 关键：如何使质粒DNA与宿主染色体 DNA分开 依据：质粒DNA 比染色体DNA小得多， 在DNA提取过程中，染色体DNA断裂 成片段(线状) ，而质粒DNA仍保持超 螺旋构型 6 变性法提取质粒DNA的原理 在变性条件（碱性或高温)下，线状染色体 DNA变性成为单链而完全分开，而cccDNA虽然 互补链之间的氢键断裂，但双螺旋主链骨架仍 彼此缠绕在一起。 当变性条件恢复时，质粒DNA迅速复性恢 复天然构型，染色体DNA难以复性，交联形成 不溶性网状结构，与变性的蛋白质和RNA缠绕 在一起，通过离心沉淀下来，而质粒DNA存在 于上清液中。 7 8 碱变性法提取质粒DNA的步骤 收集细胞沉淀 加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl, 10mM EDTA, 4~5mg/mL 溶菌酶） 在强碱性环 加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS) 境中暴露时 间过长， 加入溶液III (3M NaAc pH4.