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3 四川大学《基因工程》第三章-操作原理.pdf
第三章 基因操作的主要技术原理
1
第一节 核酸的分离与纯化
核酸包括DNA、RNA两种分子,在细胞中都
是以与蛋白质结合的方式存在的
真核生物95%DNA存在于细胞核内,5%在细
胞器
75%的RNA存在于细胞质,10%在核内,15%
在细胞器
rRNA (80~85% ),tRNA及核内小分子RNA
(10~15%),mRNA (1~5%)
2
一、核酸分离提取的原则
1. 保证核酸一级结构的完整性
2. 排除其它分子的污染
核酸样品中不应存在对酶有抑制作用的
有机溶剂和过高浓度的金属离子
将其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂
类分子的污染降到最低
排除其它核酸分子的污染
3
核酸提取的基本要求
尽量简化操作步骤,缩短提取过程,以减
少各种有害因素对核酸的破坏
减少化学因素对核酸的降解(过酸、过碱)
减少物理因素对核酸的降解(机械剪切力、
高温)
防止核酸的生物降解
4
提取核酸的一般程序:
破碎细胞 去除与核酸结合的蛋白质
及多糖等 去除其它核酸分子 沉
淀核酸,去除盐类、有机溶剂等杂质
纯化核酸 核酸的质量评估(电泳、
D260/OD280 、酶切)
5
二、质粒载体的分离与纯化
关键:如何使质粒DNA与宿主染色体
DNA分开
依据:质粒DNA 比染色体DNA小得多,
在DNA提取过程中,染色体DNA断裂
成片段(线状) ,而质粒DNA仍保持超
螺旋构型
6
变性法提取质粒DNA的原理
在变性条件(碱性或高温)下,线状染色体
DNA变性成为单链而完全分开,而cccDNA虽然
互补链之间的氢键断裂,但双螺旋主链骨架仍
彼此缠绕在一起。
当变性条件恢复时,质粒DNA迅速复性恢
复天然构型,染色体DNA难以复性,交联形成
不溶性网状结构,与变性的蛋白质和RNA缠绕
在一起,通过离心沉淀下来,而质粒DNA存在
于上清液中。
7
8
碱变性法提取质粒DNA的步骤
收集细胞沉淀
加入溶液I (50mM 葡萄糖, 25mMTris-HCl,
10mM EDTA, 4~5mg/mL 溶菌酶)
在强碱性环
加入溶液II (0.2M NaOH, 1%SDS)
境中暴露时
间过长,
加入溶液III (3M NaAc pH4.
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