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实验工艺流程原代细胞培养
一、实验目的 了解不同原代细胞的形态，掌握鸡胚成纤维细胞的制备与培养方法。 二、材料 1. 9-12日龄鸡胚 2. 照蛋灯与蛋座 3. 碘酊棉球与酒精棉球 4. 大剪子、眼科剪、小镊子 5. 平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶 6. 0.25%胰酶 7. 基础培养液：DMEM 生长液：含10%犊牛血清、200U/ml青霉素、200μg/ml链霉素的DMEM 三、细胞培养的条件要求 1）细胞密度 原代细胞：4-6×105个/ml 传代细胞：2-3×105个/ml 2）pH范围：最适pH7.0-7.4，耐受pH6.6-7.8 3）培养温度 * * 实验二 原代细胞培养 （以鸡胚成纤维细胞为例） A B A 上皮细胞 B 成纤维细胞 四、操作步骤 取9-12日龄孵育良好的鸡胚，依次用碘酊和酒精消毒气室部。 无菌操作下用剪子去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。 用眼科剪、镊去除鸡胚头、四肢及内脏，用无血清的DMEM冲冼2次。 将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。 将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5ml无血清 DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗液。如此重复1次。 加5ml胰酶，在37℃水浴中消化20-30min，其间要不时摇动，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。 消化好后，取出瓶子，静置几分钟，吸弃胰蛋白酶液。 加DMEM生长液5ml，轻轻摇动几次后，静置几分钟吸去。如此重复一次。 加入生长液5ml，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。 轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶约0.2-0.5ml，补加DMEM生长液至10ml，使细胞量约为4-6×105个/ml，盖上盖子，置于37℃恒温箱中培养。 细胞计数方法 取细胞悬液0.5ml+2ml 0.1%结晶紫—枸椽酸（0.1mol/L）溶液，室温或37℃温箱中5-10min，充分振荡后进行计数。 按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。 每ml悬液中的细胞数（n）=N/4×10000×K（稀释倍数）。 血细胞计数板 ○表示可计数 ●表示不计数
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