骨形成蛋白-7论文：腺相关病毒介导BMP-7和SOX9体外共同转染人退变椎间盘生物学效应的观察.docVIP

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2017-12-15 发布于河北
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骨形成蛋白-7论文：腺相关病毒介导BMP-7和SOX9体外共同转染人退变椎间盘生物学效应的观察.doc

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骨形成蛋白-7论文：腺相关病毒介导BMP-7和SOX9体外共同转染人退变椎间盘生物学效应的观察

骨形成蛋白-7论文：腺相关病毒介导BMP-7和SOX9体外共同转染人退变椎间盘生物学效应的观察【中文摘要】构建骨形成蛋白-7(BMP7)腺相关病毒载体质粒pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen和SOX9腺相关病毒载体质粒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato并进行腺相关病毒包装,体外共同转染人椎间盘细胞评价其生物学效应。方法：用分子克隆技术从质粒pUC57-hBMP-7获得BMP-7cDNA并克隆至AAV包装质粒pAAV-IRES-ZsGreen上,构建成pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen的AAV重组质粒,经酶切及测序鉴定后,由深圳百恩维公司对PAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen进行包装；同法获得SOX9过表达腺相关病毒pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato的包装；AAV-BMP-7与AAV-SOX9联合转染人退变的椎间盘纤维环细胞,Western blotting检测BMP-7与SOX9蛋白表达以及髓核细胞II型胶原表达量的变化。结果：经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen与pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato构建完成,荧光免疫组化显示BMP-7与SOX9蛋白表达,百恩维公司包装出具有生物学功能的AAV-BMP-7, AAV-SOX9构建成功。Western blotting显示BMP-7与SOX9在纤维环细胞中表达,AAV-BMP-7与AAV-SOX9双基因联合转染的纤维环细胞II型胶原表达量明显较AAV-BMP-7与AAV-SOX9基因转染的细胞II型胶原表达量多。结论：构建AAV-BMP-7和AAV-SOX9可在体外表达,BMP-7在体外能够协同SOX9促进退变纤维环细胞II型胶原表达增加,为BMP-7与SOX9体内实验与基因逆转椎间盘的早期退变提供了理论依据。【英文摘要】:To construct the adeno-associated virus (pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen) vector with human bone morphogenetic protein 7 (BMP7) and adeno-associated virus (pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato) vector with SOX9, and package into virus particles,and assess its biological activity and function by transducting into human disc cells in vitro.Methods:The BMP-7cDNA sequence amplified from plasmid pUC57-hBMP-7 was cloned into pack plasmid pAAV-IRES-ZsGreen. Plasmid pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen was constructed by pAAV-IRES-ZsGreen. The recombinant plasmid pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen was identified by PCR, restriction enzymesanalysis and sequencing analysis,and then package into virus particles.The package of SOX9 adeno-associated virus (pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato) was obtained in the same way. The recombinant expression plasmid AAV-BMP-7 and AAV-SOX9 was co-transfected into human annulus fibrosus cells of degenerated lumbar intervertebral discs. Westernblot was used to detect the expression changes of collagentypeⅡ.Results:The recombinant pAAV-hBMP7-IRES-ZsGreen and pAAV-hSOX9-IRES-tdTomato were completely constructed and confirmed by restriction enzymes analysis and sequencing analysis. The protein hBMP-7 and