第四章基因克隆的载体1.ppt

1.5 不同类型的质粒载体 高拷贝的质粒载体 克隆的目的是为分离大量的高纯度的克隆基因 低拷贝的质粒载体 有些克隆的编码基因，其产物含量过高会严重的干扰寄主细胞的正常新陈代谢活动。 编码表面结构蛋白质的一些基因、调节细胞基础代谢活动的蛋白质编码基因以及囊纤维化跨膜传导调节蛋白质编码基因等。 (1)失控的质粒载体 复制控制是温度敏感型的低拷贝的质粒。 Example： pBEU1和pBEU2质粒，在30度下，每个寄主细胞只含有适量的拷贝数，当培养温度超过35度时，质粒的复制将失去控制，每个细胞中的拷贝数便持续上升。在这种高温环境下，细胞的生长和蛋白质的合成可按正常的速率持续2～3小时。最后得到超量的基因编码产物，细胞生长受抑制失去存活能力，积累的质粒DNA占细胞总DNA的50%。 (2)插入失活型质粒载体 将外源DNA片断插入在质粒上会导致选择记号基因失活的位点，就有可能通过抗菌素抗性的筛选，大幅度的提高获得阳性克隆的机会。 Example： 在pBR329质粒载体的EcoR1位点插入外源片断，会使氯霉素抗性基因失活，在筛选的氯霉素敏感的转化子细胞群体中，含有插入片断的重组体质粒的几率会显著上升。 (3)正选择的质粒载体 正向选择：应用只有突变体或重组体才能正常生长的培养条件进行选择。这种质粒载体具有直接选择记号并可赋予寄主细胞相应的表型。 Example： 质粒pKN80有来自Mu噬菌体DNA的EcoR1-C的片断，编码一种致死功能的kil基因。 该质粒在Mu噬菌体的溶源菌株中正常复制；在非溶源菌株中是致死的。 在Hind? 或Hpa ?位点插入外源DNA片断后，会产生具Ampr表型的Mu噬菌体的非溶源的转化子菌株 正向选择质粒载体的条件限制： 1、需要特殊的寄主菌株或选择培养基 2、可使用的克隆位点少 3、假阳性水平高 4、不能够调节插入序列表达活性 (4)表达型的质粒载体 表达载体： 按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源真核基因的编码序列，在大肠杆菌细胞中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。 主要包括： 大肠杆菌的启动子、及操纵位点序列、多克隆位点、转录及转译信号、质粒载体的复制起点及抗菌素抗性基因。 待表达的真核基因编码序列被克隆在紧挨于启动子下游的多克隆位点上，而且必须是其编码的蛋白质氨基酸末端这一头靠近启动子方向插入，才能在启动子控制下进行有效的转录。 1.6 重要的大肠杆菌质粒载体 1、pSC101质粒载体； 2、ColE ?质粒载体； 3、pBR322质粒载体； 4、pUC质粒载体； 5、其它的重要的质粒载体 1.6.1 pSC101质粒载体 一种严谨型复制控制的地拷贝数的大肠杆菌质粒载体。平均每个寄主细胞仅有1～2个拷贝；分子量9.09kb，编码有一个四环素抗性基因（tetr ）。 有Hind? 、EcoR?、BamH ? 、Sal ? 、Xho ? 、Pvu?、 Sma ? 7种核酸内切限制酶。其中在Hind? 、 BamH ?、 Sma ?3个位点克隆外源DNA，都会导致tetr 基因失活。 是第一个真核生物的克隆载体 Example1: 应用pSC101质粒作基因克隆载体 —葡萄球菌质粒基因在大肠杆菌中的表达 金黄色葡萄球菌的质粒p1258,编码若干种能在大肠杆菌检测的结构基因；能被核酸限制酶EcoR ?切割成4段。 Example2: 应用pSC101质粒作基因克隆载体 — 在大肠杆菌中克隆非洲爪蟾DNA 用核酸内切酶EcoR ?消化非洲爪蟾的核糖体DNA（ rDNA ），与EcoR ?消化的pSC101质粒进行重组。 在挑取的55个转化子中，经 EcoR ?酶切，电泳后13个转化子含有外源片断。转化率23.6％ 1.6.2 ColE1 质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝的质粒，能产生细菌素。细菌素对大肠杆菌的正常生命活动有抑制作用（复制、转录、转译能量代谢等）。但含有对细菌素的免疫基因。 用 ColE 1质粒特征为基础建立的转化细胞系，存在一定的缺陷性： 1、应用大肠杆菌素免疫作为标记操作上不方便； 2、在细菌群体中，能够以相当高的频率自发的产生出抗菌素的突变体细胞。 1.6.3 pBR322质粒载体 “P”表示是一种质粒； “