[医学保健]基因操作中大分子的分离和分析.pptVIP

基因操作中大分子的分离和分析 三、分子杂交 分子杂交:指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或 RNA),在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火 处理,形成异质双链的过程。由于操作方式相似,通 常将检测蛋白质的抗原抗体反应也看作是分子杂交。 作用:用于检测混合样品中特定核酸分子或蛋白质 是否存在,以及其相对分子质量的大小。 分类:根据检测对象的不同可分为Southern杂交、 Northern杂交、Western杂交。 Southern杂交: 即DNA-DNA杂交分析,检测样品中特定的DNA及其含量 。 Northern杂交: 即RNA-DNA杂交分析。检测样品中是否含有特定 基因的转录产物(mRNA)及其含量 。 Western杂交: 即利用抗原-抗体反应,检测转移到硝酸纤维素 膜上的特异性蛋白质。 Southern杂交 1975年,英国Southern创建 1.是一种检测DNA分子的一种方法,通过southern印迹转移将琼脂糖凝胶上的DNA分子转移到硝酸纤维素滤膜上,然后进行分子杂交,在滤膜上找到与核酸探针有同源序列的DNA分子。 (1)待测DNA样品的制备、酶切 (2)待测DNA 样品的电泳分离:琼脂糖凝胶电泳 (3)凝胶中DNA的变性:碱变性 (4)Southern转膜: 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 (5)探针的制备 (6)Southern杂交(预杂交、杂交) 预杂交的意义:将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白 封闭起来,防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附。 (7)洗膜 经过一定的洗涤程序将游离的探针分子除 去。 (8)杂交结果的检测 3.Southern 印迹转移(转膜) 印迹转移(blotting) :通过电泳将DNA、RNA或蛋 白质样品进行分离,使不同相对分子质量的的分子 在凝胶上展开,然后将凝胶上的样品通过影印的方 式转移到滤膜上的过程称为印迹。 4.探针及探针的标记 探针:分子杂交中被标记的已知序列的核酸片断 称为探针。 (1)探针的种类: 根据探针的标记物不同:放射性探针和非放射性探针; 根据探针的来源及核酸性质不同:分为DNA探针,RNA探 针,cDNA探针,及寡核苷酸探针等几类。 Western杂交中的抗体被看作探针。 (2)探针的标记: i)标记物 同位素标记:32P、35S、3H等 非同位素标记:生物素、地高辛、荧光素等 ii)标记方法 a 均匀标记 b末端标记 a 切口平移法(nick translation):大肠杆菌的DNA聚合酶Ⅰ b 随机引物法(random primer):六核苷酸残基的引物 c PCR扩增标记法: d末端标记法: T4-多核苷酸磷酸激酶(T4-PNP) b.非放射性标记: 地高辛标记 地高辛可以与dNTP连接成地高辛-dUTP( UTP)等,参入DNA(RNA)的合成过程,形成地高辛标记的DNA(RNA)探针。 利用抗地高辛的抗体通过酶联免疫反应来完成。 Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA(主要是mRNA)的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸:RNA RNA电泳 转膜:不需变性 Western杂交 印迹转移的是蛋白质 杂交过程:抗原抗体反应 探针是针对某一蛋白质的特异性的抗体。 其他分子杂交 菌落杂交:就是将细菌菌落影印到滤膜上,或将菌种点种在滤膜上然后再生长出可见的菌落,对滤膜上的菌体进行原位裂解使 DNA 释放出来,并使之固定在滤膜上。然后通过分子杂交,判断哪个或哪些菌落含有与探针同源的DNA 。菌落杂交主要用来从用质粒或 Cosmid 构建的基因文库中寻找阳性克隆。 噬菌斑杂交:以噬菌斑改为菌落。 斑点杂交:是分子杂交中最简单的一种,直接将DNA或RNA分子以斑点的形式固定在杂交滤膜上,然后进行分子杂交。 其杂交的信号比菌落杂交和噬菌斑杂交受到蛋白质等细胞成分的干扰小,其结果的可靠性更强。 当核酸分子的斑点面积变得更小,在单位面积滤膜上处理的样品数量就更多,当检测的灵敏度进一步提高后,就发展成 DNA 芯片。 四、基因芯片技术 (一)、生