通过原位易错PCR一步构建基因突变文库.PDFVIP

微生物学通报 Apr. 20, 2014, 41(4): 719−724 Microbiology China © 2014 by Institute of Microbiology, CAS tongbao@ DOI: 10.13344/j.microbiol.china.130243 专论与综述 通过原位易错PCR 一步构建基因突变文库 2 2 2 1* 王未未 张永昌 刘明杰 邵蔚蓝 (1. 江苏大学 环境学院 生物质能源研究所 江苏 镇江 212013) (2. 南京师范大学 生命科学学院 江苏 南京 210046) 摘 要：主要介绍一种通过原位易错 PCR 构建随机突变文库的新技术。本实验室最近发表的 一项国际专利中，利用来源于海栖热孢菌的极耐热性DNA 连接酶，在传统PCR 循环中加入一 个连接步骤，即变性—退火—延伸—连接的四步循环法 PCR ，从而实现环状质粒的PCR 指数 扩增(PPCP)。原位易错PCR 中所用引物为一段线性双链DNA ，它含有与模板质粒不同的筛选 标记，产物转化宿主菌后，模板质粒在筛选平板上被直接剔除。筛选到的阳性突变子可用作模 板直接进入突变文库的再次构建，通过筛选获得二级或多级累加的正突变。利用这种方法构建 了一个木聚糖酶基因和一个纤维素酶基因的随机突变文库，并筛选出具有正向突变的蛋白，证 明以PPCP 为基础的原位易错PCR 技术，为基因定向进化提供了一种快速有效的随机突变文库 构建的新方法。 关键词：定向进化，随机突变文库，原位易错PCR ，环状质粒扩增(PPCP) One-step construction of mutagenesis libraries via in situ error-prone PCR WANG Wei-Wei2 ZHANG Yong-Chang2 LIU Ming-Jie2 SHAO Wei-Lan1* (1. Biofuels Institute, School of the Environment, Jiangsu University, Zhenjiang, Jiangsu 212013, China) (2. College of Life Sciences, Nanjing Normal University, Nanjing, Jiangsu 210046, China) Abstract: We developed a novel method to construct mutagenesis libraries via in situ error-prone PCR. One of our recent PCT patents described a novel method that adding a ligation step mediated by thermostable Thermotoga maritima (Tma) DNA ligase to form the repeated PCR cycles of “denaturation–annealing–elongation–ligation”, which allows exponential amplification