ELISPOT技术原理及其操作ELISPOT技术原理及其操作.pdf

ELISPOT 技术 在免疫学领域中,对于疾病以及疫苗研究不仅仅局限于体液免疫应答,细胞介导 的免疫应答(cell mediated immune response , CMI)也是人们所关注的,而T细 胞在 CMI 中起关键作用。在研究细胞免疫应答保护作用及其机理方面,有多种研 究方法可以使用，如： ELISA （酶标记免疫附测定法，enzyme-linked immunosorbent assay ）、流式细胞分析术（flow cytometry ）、定量RT-PCR 以及这里要介绍的近年使用越来越多的 ELISPOT。作为一项新型的免疫酶技术 ——酶联免疫斑点法(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT) ,是从单细 胞水平检测分泌抗体细胞(ASC) 或分泌细胞因子(CK) 细胞的一项细胞免疫学 检测技术。由于该方法敏感性高,易操作,成本相对流式细胞分析术也较低，已被 广泛用于分泌 CK 细胞检测或 ASC 测定中。下面将从原理、具体实验操作、技术 优势和应用几方面进行介绍。 原理 ELISPOT就其原理来说实在是很简单的，从本质上说和ELISA的原理是一样的，理 解起来并不难，关于ELISA的工作原理可看酶联免疫吸附实验（ELISA）【1】。传统的ELISA 与ELISPOT都是根据酶免疫学检测原理,通过酶的高催化频率,放大反应效果,从 而达到很高敏感度的检测效果。 如图所示，反应步骤可大致分为： 1. 利用特定细胞因子的单克隆抗体 包被96孔板， 封闭剩余的空白位点 2. 加入细胞悬液，用特异性抗原刺激、活化细胞， 产生细胞因子，细胞因子会往附近扩散与之前包 被的抗体进行特异结合 3. 洗掉细胞 4. 加入酶标二抗特异与细胞因子进行结合，通过底 物的显色反应，一个细胞所在位置就会显出斑点， 最后利用显微镜或者特定的读板机（reader）就 可以计算出样品中被激活细胞的数目 以上是检测分泌细胞因子细胞的流程，如果是检测分泌 特异抗体的细胞只需把包被特异抗体变为包被特异抗原 即可。 具体实验操作 从原理上看ELISPOT的确很简单，但是在操作过程中有许多条件需要摸索，所以 这里进一步介绍一下ELISPOT的操作步骤。 I. 将适量捕获性抗体预先包被于96孔ELISPOT板上,用胶带封板并在4℃孵 育过夜。将板用PBS洗6遍,再用含体积比10%胎牛血清(FCS)的培养基封 闭,室温下孵育至少 1h。FCS 可以封闭所包被抗体的 FCS 受体以降低非特 异性反应。有一种特殊的96孔板底面介质是PVDF膜，利用膜的多孔结构 可以让单个细胞坐到其中，然后分泌细胞因子或特定抗体，这样使最后的 检测单个细胞灵敏度成为可能。同时，PVDF 膜的不透光性也是 ELISPOT 与ELISA的不同之处。理论上是可以同时包被两个不同的抗体的，两种不 同的抗体可以利用不同的显色系统显出不同颜色，但是这样就要考虑到不 同抗体间的不亲和性，必需保证每种抗体包被的数量要足够。如果是使用 试剂盒的预包被板，这一步就可以省略啦。 II. 将阴性对照和细胞样品,如外周血单核细胞 (peripheral blood mononuclear cell, PBMC) ,经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细胞群的 4 5 PBMC,用含 10%FCS的培养基稀释至 5×10 ～2×10 个/孔如果条件可以达 到更高的细胞数，建议可以尝试 3×105 5 ～5×10 个/孔，特别是在分泌细 胞）,分装于ELISPOT板孔中,再加入特异的刺激物,如多肽或基因表达产物, 提取的抗原等,阴性对照孔中只加入培养基（实验中最好采用无血清的培