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生命科学综合实验 microRNA-194-5p 的克隆及其功能分析 胡思远 1253276 microRNA-X 的克隆及其功能分析 摘要：微小核糖核酸（Has-miR-194-5p ）是一类长20-22 个核苷酸的小分子非编 码 RNA，它通过与靶基因3端非编码序列结合促进靶基因降解或抑制翻译过程， 从而抑制靶基因表达。 本实验通过具体操作对特定基因克隆并研究其功能，从而理解并掌握基因工程的 基本思路和分子生物学、细胞生物学的核心技术。 关键词：质粒DNA，MTT，RNA 抽提纯化，逆转录PCR 引言：miRNA 参与生物体的生长、发育和凋亡的调控，并在疾病发生和发展过程 中起着重要作用。基于miRNA 所产生的多种多样的生物学功能，近年来对miRNA 的研究成为科学研究的热点之一。克隆获得特定的miRNA 是研究其功能的前提。 重组质粒经测序验证后经过质粒抽提，进行转染真核细胞，质粒pSuper 带有EGFP 标记，可以在荧光显微镜下观察转染效率，通过 MTT 实验检测miRNA 过表达对 细胞活力的影响；通过RT-PCR 检测miRNA 对其特定靶基因的表达调控；在蛋白 水平通过Western blot 进行验证。 一、实验内容 1.对特定microRNA-X 的生物信息分析； 2.人工合成shRNA 与pSuper 载体的体外连接与转化； 3.质粒DNA 的抽提与鉴定；重组质粒DNA 序列测定； 4.转染真核细胞；MTT 法检测对细胞活力的影响； 5. RNA 的抽提纯化及逆转录PCR 扩增目的基因； 6.Western blot 对特定蛋白表达的检测。 二、实验目的 （一）实验部分： 1.掌握基本的分子生物学实验技术 DNA 重组、质粒抽提、RNA 抽提、RT-PCR、 Western blot 2.掌握基本的细胞生物学实验技术细胞培养、MTT、转染 （二）理论部分：生物信息预测分析 生命科学综合实验 microRNA-194-5p 的克隆及其功能分析 胡思远 1253276 1.掌握基因克隆的策略（目的DNA 获得、体外连接方式、重组克隆的筛选与鉴定） 2.掌握基因分析的基本策略（细胞活力、mRNA 水平、蛋白水平等进行分析） 3.掌握基本的生物大分子相关的数据库的使用及相关生物信息分析软件的使用 （NCBI 数据库、Targetscan 、Pictar、mirbase 等） 实验一 对特定miRNA-X 的生物信息分析 目的：掌握对特定microRNA 的生物信息学分析 1 mirbase 使用 2 特定miRNA 序列的获得（成熟和前体序列） 3 特定miRNA target 预测分析 实验二 人工合成shRNA 分子与pSuper 载体体外连接与转化 目的：1 利用shRNA 设计的基本原理，掌握microRNA 的设计； 2 掌握DNA 酶切与连接的基本技术； 3 掌握质粒转化的基本技术。 实验三 质粒DNA 的提取、纯化与鉴定 目的: 1 掌握质粒抽提的目的； 2 了解质粒抽提原理； 3 熟悉质粒抽提方法。 实验四 转染真核细胞及MTT 法检测对细胞活力的影响 目的：1 掌握外源基因导入真核细胞的方法（磷酸钙沉淀法和脂质体法）； 2 掌握外源基因导入真核细胞的目的； 3 掌握MTT 检测细胞活力的原理； 4 了解磷酸钙沉淀法的条件优化思路和方法。 实验五 RNA 的抽提及RT-PCR 扩增目的基因 RNA 抽提目的：1.掌握RNA 操作注意事项 2.了解RNA 抽提原理 3.熟悉RNA 抽提方法 4. 了解鉴定RNA 含量和质量的方法 实验六 Western blot 对特定蛋白表达的检测 目的：1 掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白的原理 2 掌握Western blot 主要操作步骤及应用 三、实验原理 实验二 人工合成shRNA 分子与pSuper 载体体外连接与转化 1 shRNA 的设计