壳聚糖材料作为支架用于中国对虾淋巴组织细胞的体外培养 壳聚糖材料作为支架用于中国对虾淋巴组织细胞的体外培养.pdfVIP

壳聚糖材料作为支架用于中国对虾淋巴组织细胞的体外培 养 摘要 虾病的大范皤爆发使得对虾组织和细胞体外培养方面的研究引起广泛的关 注。对虾组纵和细胞的体外培养能获得细胞单层，但至今没能成功建立对虾细胞 系。需要解决的关键问题包括培养体系的优化和获得转化的细胞。对虾的外壳是 制各壳聚糖的原料之一，所以从某种程度上说，壳聚糖和对虾细胞具有同源性。 将壳聚糖材料用十对虾细胞培养是一项开创性的工作，意义深远。 采用物理交联法成功制各了壳聚糖(cs)分子量不同的壳聚糖m，B．甘油磷 酸钠(CS／a，B-GP)温敏水凝胶。流变学实验结果表明，CS／a，B—GP水溶液的成 胶温度随cs的分子量增大略有增加。不同CS／a，13-GP水溶液的成胶温度分别为： 2。c；CS2／e，13-GP，259。c：CS3／tt，13-GP，262。c：CS4／a，p-GP， CSl／a，p-GP，25 5。C。频率扫描实验的结果表明，不同温度下，储能模 27。C：CS5／a，t3-GP，27 量G’和耗能模量G”随频率的变化情况有所不同。温度低于成胶温度时，体系以 溶胶形式存在；温度接近或者等于成胶温度时，溶胶开始向凝胶转变，但是凝胶 机械强度较差；温度大于成胶温度时，形成机械强度较好的凝胶。这一结果与试 管倒置法检验溶胶．凝胶转变的实验结果是一致的。SEM结果表明，温敏水凝胶 的内部是疏松的、山不规则大孔构成的三维网络结构，表面是一层结构致密完整 的水化膜，Na平玎P元素象征着Ⅱ，0．GP的存在，双蒸水平衡以后，水凝胶中Na 和P的元素降低到极低的水平，|兑明成胶过程中cs和Ⅱ，0．GP之间没有形成新 的化学键生成。 采用传统的维织块法成功得到了原代培养的中日对虾淋巴细胞。培养7d能 得到细胞单层，细胞逐渐由圆形变成纺锤形。培养25d以后，仍然可咀观察到活 细胞，细胞问存在较多粘连的基质。将中阻对虾淋巴组织接种在csm，p-GP温 d，细胞几乎mJ满凝胶 敏水凝胶卧肝，荧光丝微镜F观察，细胞呈恻形，培养7 表而。通过测定原代淋巴细胞中过氧化物酶(POD)和碱性磷酸酶(ALP)活性 及细胞相对活力的整体水平，我们叫以知道，与传统培养方法相比，水凝胶能模 拟胞外基质环境．降低对虾淋巴细胞所受到的氧化刺激作用，并且能促进对虾淋 巴细胞的‘tb和增}直。综合比较壳聚糖的分子量对淋巴细胞生长的影响，CS3／a． 13-GP具有最好的培养效果。 传统的传代方法是胰蛋白酶消化法，fH是研究结粜表明，对虾细胞对胰蛋白 酶具有高度敏感悱，胰蛋白酶处理后细胞会受到损伤。本文采用物理方法将温敏 水凝胶破碎，使凝胶袭面的细胞丰日Ⅱ分离进而传代。台盼蓝活细胞检测法结果显 示，这种处理方法能够保持细胞活性，并且细胞粘连较少。连续传代以后，对传 代细胞进行荧光染色，从荧光照片可以看出，传至第四代，仍能观察到活细胞． 但是细胞数目显著减少。这一现象既与细胞本身有关，体外培养的细胞需要突破 M2期的限制；还可能是由于传代过程中有细胞损失造成。采用壳聚糖酶水解温 敏水凝胶，能够克服传代过程中的细胞损失，但是要控制酶作用的时间。当酶在 HBSS中作用4 h时，既能使细胞分离，又能保持较好的细胞话性。分散的细胞 贴壁培养12h后开始增殖。 采用乳化交联法成功制备了壳聚糖微球(CMs)．微球的结构致密、完整． 呈规则的球形，轮廓清晰．均一性好。将CMs与原代的淋巴细胞共混培养一定 时间后，微球的轮廓变得模糊。细胞能迁移到细胞表而并生长，说明将微球用于 细胞培养是可行的。 对n，p-GP、CS／a，9一GP温敏水凝胶和CMs进行体外细胞毒性评价。在实验 浓度范围内，q，13-GP对胎鼠成纤维细胞(MEF)有毒害作用。水凝胶和微球的 毒性通过浸提液的细胞毒性间接反应。对于CS／ct，B．GP温敏水凝胶，与对照组 相比，各实验组中细胞的相对增殖率均大于100％，表明所制备的凝胶浸提液能 促进MEF生长，_：物相容性好。水凝胶用培养液平衡以后再浸提．浸提液更能 促进细胞增殖和牛睦。随着培养时间的延长，CMs浸提液的细胞毒性降低，符 合生物安全性的要求。 关键词：壳聚糖；温敏水凝胶；壳聚糖微球；中国对虾：细胞培养