RT-PCR实验方案.docVIP

Place and Time: 资环楼303室 实验目的 在RNA水平检测野生型Col-05;1中NIP5;1基因的表达，了解并掌握RNA抽提、逆转录PCR的实验原理与方法。 实验原理 逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR) 的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针等。 实验步骤 1）RNA 提取 TRIZOL 法提取植物组织的 RNA。所有的耗材，包括离心管、枪头要用 0.1% DEPC 水处理并灭菌烘干。整个实验过程中需戴一次手套进行操作。 1.匀浆化作用 每50—100 mg组织加1 mL的Tizol，匀浆化时组织样品容积不能超过Tizol容积的10%。 2. 分离阶段 将匀浆样品在15—30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。每1 mL Tizol加0.2 mL氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒并将其在30°C下孵育2—3分钟。在2—8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA无一例外地存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加TRIZOL容量的60%。 3. RNA的沉淀 将水样层转移到一干净的试管中（宁缺毋滥），如果希望分离DNA和蛋白，有机层同样要予以保留。通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1 mL TRIZOL对应0.5 mL异丙醇。将混合的样品在15—30°C条件下孵育10分钟并在2—8°C下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。 4 .RNA的洗脱 移去上层悬液。用75%的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1 mL的 TRIZOL至少加1 mL的75%乙醇。旋涡振荡混合样品并在2—8°C下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。 5. RNA的再溶解 在操作的最后，简单干燥RNA沉淀（空气干燥或真空干燥5—10分钟）不要在真空管里离心干燥RNA。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。部分溶解的RNA样品其A260/280比值 1.6。用移液管尖分几次移取无RNA酶的水或0.5% SDS溶液来溶解RNA，并在55—60°C下孵育10分钟（当RNA以后要用于酶切反应时，避免使用SDS。）RNA还能被100%甲酰胺（除去离子）再溶解并保存在–70℃。 2）RNA质量检测及浓度测定 (1)甲醛变性胶检测RNA完整性： 配制 40 mL 琼脂糖溶液（Agarose, 0.4 g；10×MOPS, 4 mL；DEPC水, 36 mL），将其加热溶化，冷却到 70℃ 时加入 6 μL EB 和去离子甲醛（终浓度为 2%），倒入制胶板，插入梳子。待冷却后，取RNA样品2μL 于0.2 mL PCR管，并加入Loading buffer2.0 μL，于65℃ 水浴处理 10 min ，立即放置到冰水中直至点样。点样后，在电压 100 V 下电泳1 h，直至第一道溴芬兰电泳至整个胶的3/4处，在紫外灯下观察 RNA 样品是否完整。如果28S和18S条带明亮、清晰、条带锐利（指条带的边缘清晰），并且28S条带的亮度大于18S，认为RNA样品完好可用于后续实验（见下图）。 (2) 紫外分光光度法测定RNA样品浓度： 测定的Ratio值（ OD260/OD280）在1.8-2.2时，认为RNA纯度较高可用于后续实验。当Ratio值1.8时，溶液中蛋白或者时其他有机物的污染比较明显，可能对后续实验产生影响。当Ratio值2.2时，说明RNA已经水解成单核酸，则需重新取样抽提RNA。 最后将测定样品的RNA浓度统一稀释至1000 ng/μL或500 ng/μL用于后续的逆转录反应。 3）逆转录（Reverse Transcription） 将 RNA 逆转录得到CDNA第一链。按照如下体系配制 Mixture I 和 Mixture II。将 Mixture I 在 65 ℃ 下变性 5 min，迅速放置到冰水混合物中置 5 min，然后将Mixture I 和 Mixture II 混合并离心，42 ℃ 延伸 1 h。 Mixture I： ddH2O（DEPC处理） 6.