外源基因在酵母体系中表达.ppt

外源基因在酵母体系中的表达 外源基因在酵母体系中的表达 酵母菌是一种单细胞真核生物，人们对其 遗传学、生理学和全基因组序列等方面已有较为深入的研究。酵母菌在分类学上属于真菌界子囊菌纲和担子菌纲，目前已发现90多个属，700多个种，10000多个独立菌株，构成一个庞大的微生物家族。 酵母作为基因工程表达系统，既有原核生物那样生长、繁殖快速，表达量高的特点，又有与高等真核生物十分相像的蛋白质翻译后加工和基因表达调控的特征。另一方面，长期以来酵母作为工业微生物的主要菌种，在工业化发酵方面已积累了大量的经验。因此酵母表达系统是一种有着非常大的发展潜力的真核生物基因表达系统。 目前用于基因表达的酵母表达系统主要类型有以下11种： 酿酒酵母表达系统 粟酒裂殖酵母表达系统 克鲁维酵母表达系统 毕赤酵母表达系统 汉逊酵母表达系统 解脂耶鲁酵母表达系统 假丝酵母表达系统 许旺酵母表达系统 嗜腺嘌呤阿祖鲁酵母表达系统 丝孢酵母表达系统 球拟酵母表达系统 酵母附加体型载体(YEp) 酵母复制型载体(YRp) 酵母着丝粒型载体(YCp) 酵母线性载体(YLp) 酵母整合载体(YIp) 酵母人工染色体(YAC) 酵母菌启动子类型 组成型 诱导型 分泌型 复合型 第一代酵母基因工程表达系统是以酿酒酵母表达系统为典型代表。 第二代酵母基因工程表达系统的典型代表就是近年来倍受关注的毕赤酵母表达系统等为代表的甲醇酵母表达系统： 1987年Cregg等首次报道甲醇营养型毕赤酵母(Methy1otrophic Pichia pastoris)表达外源蛋白以来，由于它具有表达效率高，遗传稳定，产物可分泌表达等优点，己成为近年来极受青睐的真核基因表达系统。 短短十多年来，用该系统表达的外源基因已达三百多种，表达的产物包括细胞因子、基因工程疫苗、基因工程抗体、蛋白酶及受体等，表1为利用毕赤酵母表达的活性蛋白，其中大部分可成为医药制品，用发酵罐发酵规模可达20-50M3以上。因此，毕赤酵母表达系统的研究进展具有极重要的经济效益和社会意义。 Tab.1 Published examples of heterologous protein expression in Pichia pastoris 在基因工程表达调控水平上，巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）基因表达系统已有许多新进展。 载体类型的发展：毕赤酵母载体一般为穿梭载体(Shutt1e Vector)，通常具有甲醇精确诱导调控的醇氧化酶(Alcohol Oxidase ,AOX)启动子PAOX；根据酵母菌基因组上 AOX结构基因被外源基因所替换情况，形成Mut+或Mut-等不同表型；载体含有一个多克隆位点、AOX1转录终止序列、酵母选择标志His4以及来自大肠杆菌质粒 pBR322的Amp和ColE ori序列等。 遗传稳定性：毕赤酵母表达载体多采用整合型表达质粒，以线形化重组质粒形式整合到酵母基因组内，随着酵母宿主菌染色体的复制而复制，外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失。 载体元件的发展：除了PAOX1启动子外，还有PDAS、PGAP启动子等同样具有很高的表达效率。 选择性标记：毕赤酵母一般为营养缺陷型筛选，常用His4，也有用蔗糖酶基因SUC2和G418r、Zeocinr等。 信号肽序列：可用外源基因自身的信号肽在毕赤酵母中表达，也可用来自酿酒酵母交配因子（AMF）的信号肽序列（pre-proAMF）等，达到分泌表达的目的。此外，信号序列还可使用来自酿酒酵母的SUC2信号肽序列，酵母酸性磷酸酶基因PHO1的信号肽序列等。 目标蛋白降解：为了增加分泌蛋白的稳定性，避免被宿主菌蛋白酶降解，一些研究者使用蛋白酶缺陷型菌株。 提高毕赤酵母表达外源蛋白产量方面：虽然外源基因在整合拷贝数上大多为单拷贝整合，即可获得较高的产量，但提高拷贝数也是研究提高表达量的重要方面。 在细胞代谢调节水平上，甲醇营养型毕赤酵母的主要特征之一是能以甲醇作为唯一碳源和能源。甲醇代谢的第一个酶是醇氧化酶（Alcohol Oxidase, AOX），将甲醇氧化为甲醛（Formaldehyde）。毕赤酵母宿主菌有二种醇氧化酶基因，分别为AOX1和AOX2，二者编码核酸序列有92％的同源性，氨基酸序列有97％的同源性。 AOX1在转录水平上受到严格的双重调控：在碳源饥饿状态下，只有甲醇诱导AOX合成后才能启动PAOX进行转录和翻译；在非甲醇碳源条件下，通过基因重组插入在PAOX启动子和终止子之间的外源基因维持在表达关闭（SHUT-OFF）状态。巴斯德毕赤酵母另一重要特征是在甲醇被醇氧化酶（AOX）氧化为甲醛后有二条代谢途径： 途径之一甲醛被进一步氧化为甲酸后生成CO2释放的完全氧化途径；途径之