分光光度计的使用方法分光光度计的使用方法.doc

分光光度计的使用方法 主体内容：1．使用仪器前，使用者应该首先了解本仪器的结构和工作原理。以及各个操作旋钮之功能。在未接通电源前，应该对仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固。通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确，然后再接通电源开关。仪器在使用前先检查一下，放大器暗盒的硅胶干燥筒（在仪器的左侧），如受潮变色，应更换干燥的蓝色硅胶或者倒出原硅胶，烘干后再用。2．将灵敏度旋钮调置“1”档（放大倍率最小）。3．开启电源，指示灯亮，选择开关置于“T”，波长调至测试用波长。仪器预热20分钟。4．打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0”旋钮，使数字显示为“00.0”，盖上试样室盖，将比色皿架置与蒸馏水校正位置，使光电管受光，调节透过率“100%”旋钮，使数字显示为“100.0”。5．如果显示不到“100.0”，则可适当增加微电流放大器的倍率档数，但尽可能置低倍率档使用，这样仪器将有更高的稳定性。但改变倍率后必须按(4)重新校正“0”和“100%”。6．预热后，按(4)连续几次调整“0”和“100%”，仪器即可进行测定工作。7．吸光度A的测量按(4)调整仪器的“00.0”和“100%”，将选择开关置于“A”，调节吸光度调零旋钮，使得数字显示为“.000”，然后将被测样品移入光路，显示值即为被测样品的吸光度值。8．浓度C的测量：选择开关由“A”旋置“C”，将已标定浓度的样品放入光路，调节浓度旋钮，使得数字显示为标定值，将被测样品放入光路，即可读出被测样品的浓度值。9．如果大幅度改变测试波长时，在调整“0”和“100%”后稍等片刻，（因光能量变化急剧，光电管受光后响应缓慢，需一段光响应平衡时间），当稳定后，重新调整“0”和“100%”即可工作。10．每台仪器所配套的比色皿，不能与其它仪器上的比色皿单个调换。11．本仪器数字表后盖，有信号输出0～1000MV，插座1脚为正，2脚为负接地线。吸收池（即比色杯）使用注意事项： 要彻底清洗，尤其是盛过蛋白质等溶液，干后形成一层膜，不易洗去，通常杯子不用时可放在 1％洗洁净液中浸泡，去污效果好，使用时用水冲洗干净，要求杯壁不挂水珠，还可以用绸布丝线或软塑料制作一个小刷子清洗杯子。 严禁用手指触摸透光面，因指纹不易洗净。严禁用硬纸和布擦拭透光面，只能使用镜头纸和绸布。 严禁加热烘烤。急用干的杯子时，可用酒精荡洗后用冷风吹干。决不可用超声波清洗器清洗。 吸收池的校正：要固定参比杯和样品杯，可在杯的毛玻璃面上写上记号。用盛有参比液的参比杯和样品杯测定吸光度“A0”，样品杯换上样品液后测定的吸光度为“A1”，则校正后的实际吸光度A为：A= A1－A01.?分光光度法定义与应用 1.1?定义:?分光光度法是利用物质所特有的吸收光谱来鉴别物质或测定其含量的分析检测技术. 1.2?特点:?灵敏,精确,快速和简便,在复杂组分系统中,不需要分离,即能检测出其中所含的极少量物质. 1.3?应用:?生物化学研究中广泛使用的方法之一,广泛用于糖,蛋白质,核酸,酶等的快速定量检测.? 2.?分光光度计的基本结构和工作原理 2.1?分光光度计的分类 分光光度计的分类 红外分光光度计:?测定波长范围为大于760?nm的红外光区 可见光分光光度计:?测定波长范围为400~760?nm的可见光区 紫外分光光度计:?测定波长范围为200～400?nm的紫外光区 2.2?分光光度计工作原理 人眼可见的光只占电磁波谱的很小—部分(400~760nm)它是一种频率较大的电磁波.电磁波按频率大小,从频率最小的无线电波到频率最大的γ-射线排成一列,即组成电磁波的波谱,如下图所示.? 2.2.1?分光光度计的光谱范围 包括波长范围为400~760?nm的可见光区和波长范围为200～400?nm的紫外光区.不同的光源都有其特有的发射光谱,因此可采用不同的发光体作为仪器的光源. 钨灯的发射光谱:钨灯光源所发出的400～760nm波长的光谱,光通过三棱镜折射后,可得到由红,橙,黄,绿,蓝,靛,紫组成的连续色谱;该色谱可作为可见光分光光度计的光源. 氢灯的发射光谱:氢灯能发出185～400?nm波长的光谱,可作为紫外光光度计的光源. 2.2.2?物质的吸收光谱(1)? 如果在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液,此时在屏上所显示的光谱已不再是光源的光谱,它出现了几条暗线,即光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失,这种被溶液吸收后的光谱称为该溶液的吸收光谱. 不同物质的吸收光谱是不同的.因此根据吸收光谱,可以鉴别溶液中所含的物质.? 2.2.2?物质的吸收光谱(2) 当光线通过某种物质的溶液时,透过的光的强度减弱.因为有一部分光在溶液的表面反射或分散,一部分光被组成此溶液的物质所吸收,只有