直接从细胞培养上清液中简单高效固定胞外组氨酸标记的酶作为有活性的.docxVIP

蛋白质纯化翻译姓名：杨峰 学号：102061413３ 班级：酿酒1401直接从细胞培养上清液中简单高效固定胞外组氨酸标记的酶作为有活性的,可回收的纳米催化剂:高性能的从废油脂中生产生物柴油新加坡国立大学化学与生物分子工程摘要:一种不需要酶的预纯化的简单固定胞外酶方法取得了很大发展.固定胞外His标记的脂肪酶（His-TLL）的亲和力是通过用巴氏毕赤酵母（h-TLL）的细胞培养上清液直接处理包含长臂镍 - 次氮基三乙酸表面基团（Ni-NTA-MNP）的核 - 壳结构的氧化铁磁性纳米颗粒.让酶有高活性,专一性和高效的催化效率.用纳米生物催化剂His-TLL-MNPs催化一罐废油脂转化为生物柴油的转化效率为94%,显示出优越的回收性能. Ni-NTA-MNPs容易从循环到生物催化剂中再生并且可以反复用于酶的固定.通过从P. pastoris (h-CALB)细胞培养上清液中固定胞外His标记的南极洲假丝酵母脂肪酶B(His-CALB)证明这种方法是通用的.关键词:酶的固定 胞外酶 磁性纳米颗粒 油脂 生物柴油 脂肪酶 酶催化作用以及成为可持续生产化学产品和聚合物的重要绿色工具.固定化酶可以提高稳定性并且通过酶的回收降低酶的成本.因此,越来越多的固定化技术发展起来了.其中,把酶固定在功能性的磁性纳米颗粒上作为纳米生物催化剂吸引了很多注意,因为磁性纳米颗粒独一无二的性能,比如表面积与体积比很大,高分散性且传质限制较小,容易进行磁分离.目前,大多数固定化酶方法都要求预纯化,但这个过程都很贵而且低效.对于胞外酶来说,这个操作更加困难,因为表达的胞外酶在细胞培养液中的浓度很低.因此,开发从细胞培养液上清液直接固定胞外酶而不进行预纯化的简单有效方法是十分必要的.因此,我们要报道的方法是,先用组氨酸标记物标记目标胞外酶,然后用表面含有Ni-NTA的MNPs作为载体,通过亲和力直接从细胞培养液上清液高度特异性的吸附组氨酸标记过的胞外酶.所得到的纳米生物催化剂是有活性和可回收的,并且Ni-NTA-MNPs可以直接从用过的纳米生物催化剂中再生. TLL被选中作为目标胞外酶去证实简单固定方法和实际应用中的固定化酶.已知TLL能催化植物油和甲醇的脂交换用于生产生物柴油,一种清洁的和可再生的取代石油的柴油.然而植物油是可以食用的而且贵.最近,废油脂已经成为生产生物柴油的有吸引力的原料,因为它不可食用而且廉价.由于废油脂的高游离脂肪酸,常规的碱催化过程不再适用了.涉及FFA的酸催化脂化和随后的甘油三脂的碱催化酯交换的两步法失效了.为了高效的将废油脂转化成生物柴油,我们不断努力的开发一种一步式酯化和酯交换工艺.固定化的脂肪酶被证明是适合这个转化过程的.然而酶纯化的要求已经变成了一个阻碍发展合算的酶固定方法和废油脂转化为生物柴油技术的瓶颈.图像一: 从细胞培养液上清液直接固定胞外酶到纳米磁性颗粒上,用纳米生物催化剂的生物转化和再循环以及从使用的催化剂再生Ni-NTA-MNP。图像二:a细胞生长，蛋白质分泌和酶活性.补料分批培养期间巴氏毕赤酵母（h-TLL）在生物反应器中的细胞密度（▲），体积活性（?）和蛋白质浓度（■）。箭头表示用于蛋白质诱导的甲醇的连续进料的起始时间点。 （b，c）使用Ni-NTA-MNP以不同比例（w / w）的MNP与总蛋白（His-TLL：60％）从室温和pH 5.5的培养物上清液同时纯化和固定His-TLL的关键性能参数:（b）特异性酶负载量（Δ）和酶加载效率（?），（c）比活性（○）和总活性回收率（□）。数据是来着三分实验的具有偏差的平均值.（d）His-TLLMNPs的FESEM图像。 为了证明固定化方法,通过方案1中所示的途径合成Ni-NTA-MNPs.根据公开的方法,合成含有氧化铁核和甲基丙烯酸缩水甘油酯壳的PGMAMNP,然后用长链二胺官能化得到TDA_MNP.将长臂引入MNP的表面上是为了提供更多的空间和灵活性.以让酶被附着时仍能保持活性,然后引入醛基形成GA_MNPS,与Nα-双（羧甲基）-L-赖氨酸水合物和随后的氯化镍的进一步反应把PGMAMNP变成Ni-NTA-MNP,产率为83%.通过TEM,FESEM和DLS表征得到在每个步骤中合成的MNP的尺寸和形态.所有MNPs显示球壳结构和窄分散性。通过工程化包含pPICZαA-His-TLL质粒的巴斯德毕赤酵母（h-TLL）和在生物反应器中高细胞密度培养产生胞外His标记的脂肪酶（His-TLL）.如图2a所示,细胞在第一个13.5小时处于滞后期，之后达到对数期，在23小时细胞密度到达25g cdw / L.在该点，观察到DO值的突然升高,这意味着作为碳源