GenomiPhi扩增利用FTA技术从血样中获得的人基因组DNA.PDFVIP

GE Healthcare Lifesciences GenomiPhi 扩增利用 FTA 技术从血样中获得的人基因组 DNA Whatman™ FTA 技术为DNA 的储存和制备提供了一种前所未有的方法，利用FTA 技术获得的DNA 样品可以直接用于扩增。 Whatman FTA 产品是野外核酸采集、运输、储存和纯化最简单、有效的工具，并 且适用于各种样品来源。无论是动物、植物还是微生物细胞，只需直接将样品滴加到FTA 卡上，卡片上的化学物质就会裂解细胞、失活蛋白并捕获核酸（图1）。在整个处理过 程中，传染源也会被失活。样品干燥后，卡片上的核酸被保护免受酶、微生物、氧化剂 和自由基的损害。样品能在室温下保存数年（目前为止FTA 卡上的血样已被保存22 年 之久）。 在需要分析或使用储存在FTA 卡上的DNA 时，只需用打孔器从卡上取一个小圆片 下来，用FTA 纯化试剂洗去FTA 上的杂质，结合在小圆片上的纯化的DNA 就可以直接 用于PCR 扩增、限制性酶切反应或其他研究方法。然而，有一些研究需要用到大量的 DNA ，远远超过了小圆片上结合的DNA 甚至是整个样品中含有的DNA；还有一些应用 需要研究多个序列片段，即使多重PCR 也无法满足需求。过去，为了满足这些应用需求， 需要从更大的样品中提取DNA。全基因组扩增（WGA ）技术为从小样品中获得无限量 DNA 提供了解决方案。 用于全基因组扩增的GenomiPhi DNA 扩增试剂盒利用Phi29DNA 聚合酶和多链置换 机制，能够从ng 级线性DNA 模板中扩增得到mg 级高分子量拷贝。只需保存在FTA 卡 上少量的DNA 就能扩增得到足够多个SNP 分析和其他下游应用的DNA。（详细参见 /genomiphi ）这个应用资料提供了一个利用GenomiPhi 扩增在 FTA 卡上储存、纯化的人基因组DNA 的实例。 图 1. 滴加了血样的FTA 卡 方法 依照如下的FTA 标准流程操作，将新鲜的指尖血滴加到FTA 卡上，自然干燥。样 品在室温下避光储存5 周，在加样区用Harris 取样器取1.2 或 2.0 mm 直径小圆片，在 GE Healthcare Lifesciences 未加样的区域取空白圆片作为对照。所有圆片在200 μl FTA 纯化试剂中洗3 次，每次5 分钟，再用200 μl TE-1 (10 mM Tris, 0.1 mM EDTA, pH8.0）洗2 次，每次5 分钟。 标准GenomiPhi 扩增流程：将清洗过的小圆片分别加到9 μlGenomiPhi 样品缓冲液中。 扩增前，在对照组圆片中加入20ng 纯化的人基因组DNA ，样品在95ºC 孵育3 分钟后 置于4ºC3 分钟。每管中加入含有 1 μl 聚合酶的10 μlGenomiPhi 反应缓冲液。简单混匀 每管内容物，30ºC 孵育过夜（约16 小时），然后置于65ºC10 分钟，最后储存于4ºC 。 从每管中取 4 μl 样于含有EB 的0.6%琼脂糖凝胶上电泳。 推荐操作流程 1) 品常规保存于FTA 卡上，避光储存在干燥室温条件下 2) 用打孔器取小圆片 (血样1.2 mm) 放入管中 3) 200 μl FTA 试剂洗小圆片3 次，每次5 分钟。 4) 用200 μl TE-1 中吹洗圆片2 次，每次. 5 分钟。小圆片被完全脱色。 5) 将小圆片在室温下干燥1 小时 (可选) 6) 每管中加入 10 μl (如果圆片是湿的，加 9 μl）GenomiPhi 样品缓冲液。 7) 95ºC 孵育3 分钟后转置于冰上。 8) 如需要，快速离心以收集冷凝物。 9) 加10 μl GenomiPhi 反应混合物（含有 1 μlPhi29 聚合酶）混匀。 10) 30ºC 孵育过夜（约16 小时）。 11) 65ºC 孵育10 分钟，储存于4ºC 。 结果 图 2. 在FTA 卡上获得的人基因组DNA 扩增后凝胶电泳图 GE Healthcare Lifesciences Lane M:1 kb DNA ladder Lane 1:阳性对照DNA (非 FTA 法) Lane 2:阴性对照(无 DNA 或 FTA) Lanes 3-5