含抗真菌肽基因拟靶昆虫搜查和dros克隆研究.pdf

摘 要 目前已分离鉴定的昆虫抗菌肤达200多种，但绝大部分对真菌无 明显效果。近10年的研究发现，在某些昆虫的防御系统中可产生对真 菌有杀伤力的抗真菌蛋白 (antifungalprotein)，有些昆虫抗菌肤， 特别是新发现一些属昆虫防御素族的抗菌肤，具有较广谱的抗真菌或 同时兼具抗细菌作用，不仅对昆虫病原真菌，而且对某些植物病原真 菌、人类病原真菌也都有强抑制作用，文献上将此专称为 “昆虫抗真 菌肤 (insectantifungalpeptide)”。 目前从昆虫中新分离纯化得到的抗真菌肤还为数不多，大约10多 种，并且对它们的深入研究报道也有限。鉴于抗真菌肤在农业生产、 农药、医药等方面有巨大的开发前景，特别是加入WTO后，由我国自 主发现、鉴定新的昆虫抗真菌肚的研究意义极其重要。另一方面，对 已发现的昆虫抗真菌肤因子比如具有既抗真菌又抗细菌的双效抗性的 抗真菌肤thanatin基因、从模式昆虫果蝇中分离的对丝状真菌具有强 烈抑杀作用但对细菌无抗性的Drosomycin基因等进行更深入的研究， 则有现实的开发应用价值和理论研究意义。 本论文以在基因组水平上搜查含新的昆虫抗真菌肤基因的靶昆虫 和克隆果蝇Drosomycin基因(dros)为研究目的，取得了以下新结果: 根据GenBank公布的已知的果蝇抗真菌肤Drosomycin基因6个登 录序列的氨基酸高同源区段设计合成一对简并引物Drsl/Drs2，以对 可能含有抗真菌肤基因的12种拟靶昆虫进行搜查。研究中采用 “热启 动法”PCR扩增试验，并创建了单、双引物对比扩增方法以锁定拟靶 基因序列的扩增带，结果发现昆虫A,D,E,H、工、7显示出阳性信号， 初步确定了此6种昆虫为今后继续进行深入研究的新的可能含有抗真 菌肤因子的靶昆虫，并为克隆表达鉴定新的昆虫抗真菌肤基因序列奠 定了初步基础。 论文同时根据文献己报道的东北大黑鳃龟抗真菌肤holotricin3 基因和黄色粉蛀虫抗真菌肤tenecin3基因的氨基酸序列富含甘氨酸、 组氨酸的特点，并分析其高同源性区段，设计合成另一对简并引物 HT1/HT2，对上述12种昆虫同样进行PCR扩增筛查，但没有得到预期 结果，论文对此原因进行了分析和探讨。 尝试对果蝇抗真菌肤Drosomycin基因进行了克隆研究。论文根据 含信号肤的 Drosomycin基因 。DNA序列设计一对特异引物 Drosl/Dros2(两端含酶切位点)，运用 PCR方法，从黑腹果蝇 (OrOsophlzamelanogaster)基因组 DNA中获得含信号肤的 Drosomycin基因 (dros)扩增带，将其插入到载体pET-21d中，对经 EcoRI和BadiI酶切和PCR双重鉴定后的重组质粒pET-2ld-dros中 的dros插段进行测序，结果表明dros插段为228bp，其碱基序列与 文献(PascaleFelbaumeta].,1994)报道的Drosomycin基因比较， 仅在非功能位点上有 1个碱基的差异(即++116位点:T/A)，其它序 列则完全相同，进一步证明本次试验已成功地由黑尾果蝇基因组获得 全长Drosomycin基因序列。论文成功地构建了含Drosomycin基因的 重组表达载体pET-2ld-dros，进一步表达鉴定仍在进行之中，可为今 后从事生物制药开发、转基因研究提供准备，也可为今后进行新的昆 虫抗真菌肤研究提供参照。 关键词:昆虫抗真菌肤 简并引物 搜查 克隆 论文正文缩写词英汉对照 Amp ampilillin 氨节青霉素 by basepair 碱基对 cDNA complementarydeoxyribonucleicacid (与RNA)互补DNA Da(KDa) dalton(kilodalton) 道尔顿(千道尔顿) ddHZ0 doubledistillatoryH20 双