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用于结晶和3D结构测定的一种不稳定的氧敏感酶的纯化
用于结晶和 3D 结构测定的一种不稳 Application Note
定的氧敏感酶的纯化 ÄKTAFPLC ®
使用预编方法模板和搜索功能对分离 中。通过自动筛选不同的层析填料和梯度优
条件的方便优化 化开发方法。这通过预编制方法模板十分方
便。最终的方法包括Q Sepharose XL的离子
用现代化的制备型分离填料和策略纯 交换层析、SOURCE 15ISO的疏水作用层析
化设计的快速纯化 和Superdex 75 prep grade的凝胶过滤层析。
此工艺产生10 mg纯的活性DAOCS ,它被用
高度不稳定的酶纯化到“ 结晶级”纯度 于结晶和随后的3D结构测定。
的分离
介绍
摘要
带有活性的高度不稳定蛋白的分离是蛋白
应用ÄKTAFPLC 开发了一种用于参与头孢 质化学中的一个众所周知的难题。这个任务
菌素/头霉素生物合成的脱乙酰氧基头孢菌 在结构生物学中可能特别具有挑战性,只有
素C合成酶(DAOCS )快速纯化的程序。目 具有活性、纯的蛋白制备物才能用于X射线
的是生产活性酶制备物,用于生成足够纯度 衍射晶体学的研究。全面的纯化策略和各个
的晶体用于X射线衍射分析。DAOCS基因以 步骤如何被设计和执行对于决定最终的蛋
可溶性的形式过表达在大肠杆菌的细胞质 白制备物的质量是关键的因素。
图1.纯化的DAOCS 的晶体(a )、衍射图(b )和高分辨率电子密度图(c )。图由Uppsala ,瑞典农业科学大
学分子生物学系的Inger Andersson教授和Anke Terwisscha van Scheltinga博士以及瑞典Uppsala大学生物化
学系的Karin Valegård提供。
在这个工作中开发了用于氧敏感酶脱乙酰 开发的工艺可被放大至少10 倍
氧基头孢菌素C合成酶(DAOCS )的纯化设
计。这种酶催化链霉菌中头孢霉素/头霉素 为了快速达到对纯度和产量的要求并利用
生物合成的一个关键步骤。目前在深入研究 最简单的可能的设计,使用下列方法:
下DAOCS属于一类非血红素亚铁依赖的氧 1) 根据不同的参数(例如电荷、疏水性和
酶(例如见Roach et al, 1997 )。 分子大小)选择分离纯化技术。
2) 合理衔接这些技术以便尽可能减少两
链霉菌属中DAOCS 的基因编码被克隆并以 个纯化步骤之间所需要的样品处
可溶性蛋白的形式在大肠杆菌细胞质中表 理。
达。早期试验清楚地表明较短的纯化时间能 3) 纯化方案由捕获、中间纯化和精细纯化
够提高晶体质量,可能是由于减少了氧化修 步骤组成,且对每个步骤都制定一个特
饰的水平。为了减少总的纯化时间,早期的 殊的目的。
多天纯化程序因此成为这项工作中的主要 4) 在小(1 ml)层析柱上进行用于定性评
问题。此应用指南介绍了产生足够质量的 估的快速
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