电泳纯度(非还原型SDS-PAGE)测定标准操作规程.docVIP

细胞因子电泳纯度（非还原型SDS）测定标准操作规程 依据：《中华人民共和国药典》2005年版第三部。 范围：适用于细胞因子纯度的检测。 目的：检测细胞因子蛋白质纯度。 原理：蛋白质具有不同的电荷和分子量，在经过阴离子去污剂SDS处理后，蛋白质分子上的电荷被中和，在聚丙稀酰胺凝胶电泳时，不同的蛋白质按照其分子量大小进行分布，电泳迁移率仅取决于蛋白质的分子量。由于不连续的PH梯度作用，样品被压缩成一条狭窄区带，采用染色液染色，经扫描仪扫描胶片可及时观察结果。 内容： 1 材料 1．1样品：经二人复核批号无误后检测 1．2试剂 甲醇 CH3OH 分析纯 无水乙醇 CH3CH2OH 分析纯 浓盐酸 HCl 分析纯 甘油 C3H8O3 分析纯 硝酸银 AgNO3 分析纯 重铬酸钾 K2Cr2O7 分析纯 正丁醇 C4H9OH 分析纯 甲醛 HCHO 分析纯 丙烯酰胺 CH2CHCONH2 分析纯 甲叉双丙烯酰胺（CH2CHCONH2）2CH2 分析纯 过硫酸铵 （NH4）2S2O8 分析纯 TEMED（四甲基乙二胺）(CH3)2N(CH2)2N(CH3)2 分析纯 甘氨酸 C2H5NO2 分析纯 SDS（十二烷基硫酸钠）C12H25O4SNa 分析纯 乙酸 CH3COOH 分析纯 碳酸钠 Na2CO3 分析纯 溴酚蓝 C19H10Br4O5S 分析纯 1．3注射用水：符合《中华人民共和国药典》2005年版要求。 1．4设备 1．4．1扭力天平 上海第二天平仪器厂 1．4．2垂直板状电泳槽 北京东方仪器厂 1．4．3恒温恒流电泳仪 法玛西亚公司 1．4．4快速电泳槽 BIORAD USA 1．4．5全自动扫描仪 CS-930 日本岛津 1．4．6 TS-1型摇床 1．5器皿：500ml瓶、100ul移液器、1ml吸管、10ml吸管3000ml三角瓶、平皿、1000ml烧杯、80ml烧杯，以上器皿经本室洗刷组处理。 2 方法 2．1准备工作 2．1．1工作环境：控制区，确认场地清场合格，摘下“清场合格”标志牌，挂上“使用中”标志牌。 2．1．2调试仪器设备 2．1．2．1恒温恒流电泳仪工作状态良好，已经挂“备用”标志牌。 2．1．2．2全自动扫描仪工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。 2．1．2．3扭力天平工作状态良好，已挂“备用” 标志牌。 2．1．3摘下扭力天平“备用” 标志牌，挂“运行中” 标志牌。 2．1．4配液：以下溶液的配制完成后，均需经二人复核无误后，在瓶外贴标签，注明溶液的名称、浓度、体积、批号及配制日期。 2．1．4．1聚丙烯酰胺凝胶母液 100ml 用扭力天平准确称取丙烯酰胺30g, 甲叉双丙烯酰胺0.8g，加50ml注射用水溶解后定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。一般不超过1～2个月。 2．1．4．2分离胶缓冲液 100ml 用扭力天平准确称取Tris18.15g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调节pH8.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。 2．1．4．3浓缩胶缓冲液 100ml 用扭力天平准确称取Tris6.05g，溶于80ml注射用水中，溶解后，加浓盐酸调pH6.8，补加注射用水至100ml，置于250ml瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，4℃冰箱放置。 2．1．4．4 1%SDS 50ml 用扭力天平准确称取SDS 0.5g，溶于50ml注射用水中，溶解后，置于棕色瓶中，二人复核，贴签，标明溶液的名称、浓度、体积、批号、配制日期，常温保存。 2．1．4．5 1% TEMED 50ml 用吸管准确吸取TEMED0