SOP-C SDS-PAGE凝胶电泳标准操作规程.docVIP

审批及颁发： 部 门 签 名 日 期 起 草 质量部 审 核 质量部 批 准 质量受权人 颁 发 质量部 会审： 部 门 签 名 日 期 部 门 签 名 日 期 分发： Copy-1 Copy-2 Copy-3 Copy-4 Copy-5 Copy-6 Copy-7 Copy-8 Copy-9 Copy-10 Copy-11 Copy-12 Copy-13 Copy-14 Copy-15 目的 建立重组人生长激素电泳检查标准操作规程，使中间产品检验有据可依。 范围 适用于本公司中间产品“重组人生长激素” 的电泳检查。 职责 1 质量部负责制定本规程。 2 QC人员负责按照本操作规程的规定操作，并做好记录。 3 QC室主任负责监督QC人员按照本规程的规定操作实施。 术语 无 内容 1 仪器、设备 恒压电源、垂直板泳槽和制胶模具。 试剂 检查所需试剂是否在有效期内，未准备好的及时配制，缺少的试剂及时申购。 所需试剂有： 2.2.1 水：电阻率应不低于18.2MΩ.cm。 2.2.2 A液：（ 1.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液） 称取18.15g三羟基氨基甲烷，加适量水溶解，用盐酸调pH值至8.8，加水稀释至100ml。 2.2.3 B液：30%丙烯酰胺-0.8%N，N`-亚甲基双丙烯酰胺溶液（避光保存）。 2.2.4 C液：1%十二烷基磺酸钠溶液。 2.2.5 D液：10%四甲基乙二胺溶液。 2.2.6 E液：10%过硫酸铵，临用前配置。 2.2.7 F液：（0.5mol/L三羟基氨基甲烷-盐酸缓冲液） 称取6.05g三羟基氨基甲烷加适量水溶解，用盐酸调pH值至6.8，加水稀释至100ml。 2.2.8 电极缓冲液：称取3g三羟基氨基甲烷，14.4g甘氨酸，1g十二烷基磺酸钠，加适量水溶解，用盐酸调PH值至8.3，加水稀释至1000ml。 2.2.9 供试品缓冲液：称取0.303g三羟基氨基甲烷，0.189ml盐酸，4ml甘油，2mg溴酚蓝，0.8g十二烷基磺酸钠，加水溶解并稀释至10ml，此溶液用于非还原SDS。如用于还原SDS，则再加2mlβ-巯基乙醇。 2.2.10 固定液：取量250ml乙醇,60ml冰醋酸,加水稀释至500ml。 2.2.11 考马斯亮蓝染色液：称取1g考马斯亮蓝R250，加乙醇200ml，冰醋酸50ml，加水至500ml，混匀。 2.2.12 考马斯亮蓝脱色液：取乙醇400ml、冰醋酸100ml，加水至1000 ml，充分混合。 2.2.13 考马斯亮蓝保存液：取冰醋酸75ml，加水至1000ml，摇匀。 方法 3.1 原理 大多数蛋白质与阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠（SDS）按重量比结合成复合物，使蛋白质分子所带的负电荷远远超过天然蛋白质分子的净电荷，消除了不同蛋白质分子的电荷效应，使蛋白质按分子大小分离。 3.2 凝胶的制备 凝胶种类 分离胶 浓缩胶 凝胶浓度 5. 0% 7．5% 10. 0% 12．5% 15. 0% 17．5% 4．5% 试液/ml A液 4. 0 4. 0 4. 0 4. 0 4. 0 4. 0 B液 2．7 4. 0 5．4 6．7 8. 0 9．4 1．35 C液 1．6 1．6 1．6 1．6 1．6 1．6 0．9 D液 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．07 E液 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．1 0．07 F液 2．25 H2O 7．3 6. 0 4．88 3．3 2．88 0．88 4．33 3.2.1 制备分离胶溶液 按上表15％或12.5%制成分离胶溶液，灌入模具内至一定高度，加水封顶，室温下聚合（室温不同，聚合时间不同）。 3.2.2 制备浓缩胶溶液： 待分离胶溶液聚合后，用滤纸吸去上面的水层，再灌入浓缩胶（配方见上表），插入样品梳，注意避免气泡出现。 3.2.3 凝胶保存 凝胶应在室温条件下聚合，可在室温或2-8℃冰箱保存一周，如遇胶体失水严重，应重新配制。 3.3 样品处理 3.3.1 发酵液： 取发酵液1.5ml于1.5ml离心管中， 10000rpm/min离心10min，弃去上清，留沉淀，再加入1ml 10mmol T.E ，充分混匀，将其稀释3倍（1倍样品加2倍水），取样20ul与还原样品缓冲液20ul置于0.5ml离心管中，混匀，置沸水浴中煮10min到15min后与对照品于同一块胶上样。 3.3.2