转基因动物生物反应器.pptVIP

转基因动物与生物反应器 一 基因工程 基因工程技术的特点是基因体外重组，即在离体条件下对DNA分子切割并将其与载体DNA分子连接，得到重组DNA。 世界上第一批重组DNA分子诞生于1972年，次年几种不同来源的DNA分子装入载体后被转入到大肠杆菌中表达，标志着基因工程正式登上历史舞台。 二 转基因动物 所谓转基因动物（Transgenic animal）是指在基因组内稳定地整合以实验方法导入的外源基因，并且外源基因可以稳定地遗传给后代的遗传工程动物。 转基因动物技术基础 重组DNA技术 胚胎移植技术 体细胞克隆技术 基因定向整合技术 1980年，Gordon等人首先育成转生长素基因小鼠 显微注射纯化的DNA的方法。 生长速度快2－4倍、体形大一倍的转基因“硕鼠”。 从此转基因动物技术轰动了整个生命科学界。 发表在1982年的nature杂志上。 我国状况 1989年，快速生长的转基因猪 1990年，快速生长的转基因兔 1991年，快速生长的转基因羊 三 转基因动物的关键步骤 外源目的基因的制备 外源目的基因有效的导入生殖细胞或胚胎干细胞 选择获得携有目的基因的以上细胞，选择合适的体外培养系统和宿主动物 转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系 核心技术 目前，制备转基因动物的主要方法有： 基因显微注射法 胚胎干细胞移植法 反转录病毒感染法 精子载体导入法等。 1 原核期胚胎显微注射法 基本原理是：通过显微操作仪将外源基因直接用注射器注入受精卵（原核胚胎的原核内），利用受精卵繁殖中DNA的复制过程，将外源基因整合到DNA中，再发育成转基因动物。 P258 主要步骤 目的DNA制备与纯化； 动物的挑选、超排卵与取卵； DNA的注入； 卵的转移； 转基因动物的获得 详解 约400倍的显微镜下，用一根直径80-100微米的玻璃棒将胚胎固定，再用另一根直径1-5微米的玻璃管刺入细胞原核，把DNA溶液直接注射到原核期胚胎的一个或两个原核中。 胚胎再经过1-3小时培养，证明没有裂解后，移植到受体母畜的输卵管内；也可体外培养发育到桑椹胚再进行胚胎移植。 转基因胚胎的鉴定 标记基因筛选 绿色荧光蛋白基因、荧光素酶基因 在荧光显微镜下观察，阳性胚胎中全部细胞发出荧光。 分子技术筛选 采用胚胎切割的方法获得细胞，进行DNA提取后，采用PCR扩增、southern杂交等手段检测。 举例——显微注射生产转基因羊P251－258 羊的超数排卵 受精卵采集 显微注射 胚胎移植 体内发育 出身、鉴定 优点 是目前最成熟的转基因动物制备方法 不足——1.成功率较低 最多1%。至今未取得改进。 每生产一头转基因羊或猪，大体需要注射100个单细胞胚。 每生产一头转基因牛，需要注射500-1000个单细胞胚胎。 2.需要大量的受体动物 每生产一头转基因牛需要使用几百头牛做受体。 3.基因非定向整和 基因随机整和。 大多数转基因动物都表现出一定生理异常。 基因产品的生理功能会改变。如：生长激素受下丘脑控制，而转基因动物的生长激素却在肝脏等中表达，不受生理调节。 研究现状 转基因改变家畜经济性状的研究降温，而动物生物反应器研究成为热点。这是因为：在一些特殊组织或器官中表达外源基因对动物危害轻，而且不一定非要生产纯合动物。 2 反转录病毒感染法P258。 将目的基因重组到反转录病毒载体上： （1）人为感染着床前或着床后的胚胎。 （2）直接将胚胎与能释放反转录病毒的单层培养细胞共孵育以达到感染目的。 可通过病毒将外源目的基因插入整合到宿主基因组DNA中。 不足 载体容量太小，可插入的目标基因最大允许长度是8KB。 不能控制转染时间。 至今没有一头成功，几乎都是嵌合体。 3 胚胎干细胞方法 胚胎干细胞（ES）当被注入囊胚腔后可以参与包括生殖腺在内的各种组织嵌合体的形成。 将外源DNA导入胚胎干细胞就可以实现基因的转移。 P259。 4 利用胚胎干细胞和胚胎移植技术实现转基因动物制备 从胚胎分离出胚胎干细胞，通过转录将外源基因导入细胞内，再将其转入到植入前胚胎的胚泡腔。 这些带有外源基因的胚胎干细胞可嵌入宿主囊胚的内细胞团中参与胚胎发育。 出生的动物其生殖系统就有可能整合上外源基因。 再通过杂交繁育就可得到具有纯合目的基因的个体，即转基因动物。 5 精子载体法 显微注射技术的效率很低，设备昂贵。 直接用精子作为外源DNA载体的转移方法。 P260 基本原理和方法 精子直接与外源DNA混合培养，外源基因可以直接进入精子头部，受精后就可发育成转基因动物。 后来Rottman对此方法进行了改进，将外源DNA在与精子共孵育之前用脂质体包埋，使脂质体与DNA相互作用形成脂质体——DNA