腺相关病毒载体介导人βNGF和PDGFB基因联合转染猫角膜内皮细胞的实验研讨.pdfVIP

内皮细胞的实验研究 中文摘要 目的：通过腺相关病毒(AAV)载体介导人B一神经生长因子(B-NGF)基因和人 血小板源性生长因子基因B(PDGF．B)联合转染体外培养的猫角膜内皮细胞，探 讨其对该细胞生物学效应的影响。 方法：体外培养的猫角膜内皮细胞，通过细胞形态学观察、神经特异烯醇化酶 (NSE)单克隆抗体免疫荧光染色鉴定细胞的种类及纯度。构建从V载体，利用 从V载体介导绿色荧光蛋白(GFP)基因转染猫角膜内皮细胞，根据其阳性表达率 测定转染效率。从V—B-NGF和AAV—PDGF—B分别和联合转染猫角膜内皮细胞后， Real-Time PCR及Western 角膜内皮细胞72小时后，通过m检测细胞增殖能力的改变，流式细胞仪测定 处于G1期的细胞比例，检测外源基因对细胞周期的影响。划痕实验观察从v—B -NGF和从V—PDGF-B对细胞迁移能力的影响。’ 结果：猫角膜内皮细胞体外培养可形成完整的细胞单层，经形态学观察、NSE免 疫荧光染色证明为纯净的猫角膜内皮细胞。AAV介导的绿色荧光蛋白基因转染猫 角膜内皮细胞72h后，荧光显微镜下观察可见细胞内清晰的绿色荧光，测得转染 效率可达67．8％。从V一9-NGF和从V—PDGF-B分别和联合转染猫内皮细胞后， Real-TimePCR和Westernblot结果显示，转染后各时间点猫角膜内皮细胞中 从V—PDGF—B分别和联合转染猫角膜内皮细胞后增殖能力较对照组增强，联合转 染组更为明显，差别均有统计学意义(P0．05)。流式细胞仪检测从V—B_NGF 和从V—PDGF-B转染组细胞周期中Gl期细胞比例增加，联合转染组增加更为明显。 划痕实验表明，从V—B—NGF和AAV—PDGF—B转染后可以增强细胞迁徙能力，联合 转染组效果更为明显，差异具有统计学意义(PO．05)。 结论：从V可有效介导人B-NGF基因和PDGF-B基因转染体外培养的猫角膜内皮 细胞，并在猫角膜内皮细胞中持续稳定表达。从v_B-NGF和从V—PDGF-B分别和 联合转染猫角膜内皮细胞后可以增强细胞的增殖和迁移能力，联合转染的效果更 加明显。 ㈤lilt I T IFITIIII IIIIIII 博士研究生：杨珊珊(眼科学) 指导教师：王传富教授 关键词：角膜内皮细胞；腺相关病 源性生长因子B；转染 incatcorneal ofhumanfl-NGFandPDGF-B Co-transfeetion gene cellsvia virusmediation endothelialadeno．associated Abstract virus researchthe effectofco-lransfe％-tionofadeno·associated PURPOSE：Tobiological (AAV)mediatedhumanncfvc human derived growthfactor-8(8-NGF)andplatelet incat invitro． factor cornealendothelialcells growthB(PDGF．B1 1垤ETHODS：Catcornealendothelialcellswe∞culturedinvit