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一例牛肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌混合感染的诊断报告 黄敬斌 吴翠兰 李军 陶立 南宁市江南区沙井街道办事处水产畜牧兽医站 广西兽医研究所 广西兽医生物技术重点实验室 X 关注成功！ 加关注后您将方便地在 我的关注中得到本文献的被引频次变化的通知！ 新浪微博 腾讯微博 人人网 开心网 豆瓣网 网易微博 摘????要： 近年来, 随着牛养殖规模的增加, 混合感染引发的疾病较严重。广西某牛场送来一例奶牛急性死亡病例, 通过临床观察、细菌分离鉴定、病原鉴定、致病性试验和药敏试验的方法进行诊断。检测结果发现, 内脏有明显的病理变化, 从腹股沟淋巴结和脾脏分别分离出两种菌, 经测序鉴定为肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌, 且对小白鼠的致死率分别为80%和100%。17种药物的药敏结果显示这两种菌只对阿米卡星、大观霉素等少数几种抗菌药物敏感。PCR或RT-PCR未检测出IBRV、BPIV3、牛支原体。结论确诊该病例为肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌混合感染。 关键词： 肺炎克雷伯氏菌; 大肠杆菌; 混合感染; 作者简介：李军 E-mail:jlee9981@163.com。 基金：广西重点研发计划 (桂科A 2017年4月某牛场发生了一例奶牛急性死亡病例, 该奶牛产犊后不久, 出现体温升高, 呼吸急促, 第二天死亡。剖检发现肺、肝、脾、心、子宫、腹股沟淋巴结及肠道都有明显的病理变化, 表现为肺、心出血, 肝肿大, 脾肿大且有灰白色坏死灶, 子宫化脓, 腹股沟淋巴结肿大、出血和肠道严重出血。经临床诊断和实验室检测, 确诊为肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌混合感染, 现将结果报道如下。 1 材料与方法 1.1 实验室诊断 1.1.1 细菌分离鉴定 无菌操作将病死牛的上述组织器官划线接种于血平板和麦康凯平板上, 置于37℃培养18h~24h。从腹股沟淋巴结和脾脏分离的细菌在血平板和麦康凯培养基上都有生长, 将这两种菌落称为LZ1菌和LZ2菌。然后分别挑取单个菌落进行纯培养和革兰氏染色后镜检, 观察细菌形态。运用细菌通用型引物16S对上述细菌的DNA进行PCR扩增, 测序。 1.1.2 病原鉴定 采集病死牛的肺等器官, 运用RT-PCR或PCR的方法对牛传染性皮气管炎病毒 (IBRV) 、牛副流感3型病毒 (BPIV3) 、牛支原体进行检测。 1.1.3 致病性试验 将30只6周龄健康的小鼠随机分成3组, 分别为LZ1菌感染组、LZ2菌感染组、对照组, 每组各10只。然后, 将LZ1菌纯培养液 (2×10CFU/m L) 、LZ2菌纯培养液 (2×10CFU/m L) 和无菌的纯培养液分别腹腔注射接种, 剂量为0.5m L/只, 观察小鼠的生长状况。 1.1.4 药敏试验 用17种常用抗菌药物分别对LZ1菌和LZ2菌进行药敏试验, 置于37℃培养12~24h, 观察结果。 2 结果 2.1 细菌分离鉴定 在麦康凯平板上, 菌落 (LZ1菌) 呈奶油状, 用接种环挑之, 出现拉丝的现象, 另外的菌落 (LZ2菌) 则不出现上述情况。光学显微镜下观察, 两种菌均为革兰氏阴性短杆菌。用细菌通用引物16S进行PCR扩增, 电泳观察结果 (图1) , PCR产物测序结果表明, LZ1菌为肺炎克雷伯氏菌, LZ2菌为大肠杆菌。 2.2 其他病原鉴定 对IBRV、BPIV3、牛支原体进行检测, 结果为阴性, 说明未检测到上述3种病原。 图1 细菌通用型16S的PCR结果 ??下载原图 M:Marker DM2000;1:LZ1;2:LZ2;3:阴性对照 2.3 致病性试验 结果发现LZ1菌和LZ2菌感染组均能使小鼠致死, 且致死率分别为80%和100%, 而对照组的未出现死亡。 2.4 药敏试验 药敏试验结果见表1, 由表可知LZ1菌对阿米卡星、大观霉素、头孢噻肟中敏;对头孢拉定和头孢曲松低敏;对环丙沙星等12药物具有耐药性。LZ2菌对大观霉素、阿米卡星、利福平中敏;对庆大霉素低敏, 对环丙沙星等13种药物具有耐药性。 根据临床发病情况、剖检病变、病原分离鉴定及RT-PCR/PCR方法、药敏试验和致病性试验综合分析情况, 该病诊断为肺炎克雷伯氏菌和大肠杆菌混合感染。 表1 药敏试验结果 ?? 下载原表 3 讨论 3.1 牛肺炎克雷伯氏菌病是由肺炎克雷伯氏菌侵害牛呼吸道系统、肠道而引起的支气管炎、肺炎、败血症、肝脓化、伤口感染等疾病, 其发病和死亡率极高[1]。 大肠杆菌病是由多种血清型病原性的大肠杆菌引起幼畜严重腹泻、脱水和败血症等多种疾病[2], 甚至可造成死亡, 给养殖业带来巨大的经济损失, 病牛和带菌动物是该病的传染源, 可通过食物、水、密切接触等方式传播。 3.2 致病性试验结果表明, 肺炎克雷伯菌和大肠杆菌分别腹腔注射小鼠体内均