CTAB提取植物DNA的方法及各试剂的作用.doc

( 1) 称取1~ 2. 0 g的植物幼嫩叶片, 用蒸馏水冲洗干净，再用灭菌水冲洗两次，搁置于研钵中, 加入液氮, 轻轻捣碎叶片, 等液氮快挥发完时, 快速研磨到粉状(越细越好) , 把粉末转移到有标记的2mL无菌离心管中。此步操作应戴手套,防止皮肤冻伤。 ( 2) 加入650 ??L预热的DNA 提取缓冲液, 用力振荡1~ 2m in, 马上放入65 % 水浴锅中保温45 min以上, 其间, 每隔15 m in用手轻微振荡3或4次。 ( 3) 从水浴锅中取出样品管, 加入650 L预冷的241的氯仿异戊醇, 盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5~ 10m in。 ( 4) 在10 000 r /m in下离心10m in。 ( 5) 用移液枪缓慢吸取上层清液约500~ 700 ??L到做好标记的1. 5 mL 离心管中。此步操作应非常小心, 注意不要吸得过多、过快, 避免振荡, 以免造成蛋白质污染; 如果离心层因振荡引起上清液浑浊, 将影响提取效果, 此时须要再离心。 ( 6) 在获得的上清液中加入预冷的异丙醇, 加入量按吸取上清液体积的2 /3计, 约330~ 470 L。轻轻上下摇动离心管, 注意观察DNA 将从溶液中析出。如溶液中DNA 含量较少, 将会观察到管中含有白色悬浮的DNA 颗粒; 如样品中DNA 含量较高, 则可观察到 白色絮丝状的DNA 悬浮于溶液中。 ( 7) 此步可根据学时数灵活掌握。或静置此样品于4% 冰箱1 h, 或过夜, 或马上在8 000 r/m in 条件下离心5m in, 继续提取DNA。 ( 8) 离心后, 小心倒掉上清液, 用纸吸去管壁处多余的溶液, 保留DNA沉淀于管底。 ( 9) 加入70% 乙醇600 ??L洗涤沉淀, 振荡起沉淀数秒钟, 5 000 r /m in条件下离心去上清液。再重复步骤( 9)洗涤沉淀1次。 ( 10) 室温下干燥DNA 沉淀, 在见到无色胶状物附在管壁时, 加入80 ??L 无菌蒸馏水溶解沉淀的DNA。 ( 11) 此步用于要求较高的科研中。一般来讲,RNA 不影响DNA 特性的分析, 如想获得不含RNA 的DNA 样品, 在提取获得的DNA 样品管中加入2 LRNase, 就可得到高质量的DNA 样品。 ( 12) 得到的样品于冰箱- 20% 保存备用。 ( 13) 采用紫外分光光度计法检测DNA 的含量, 检测260、280 nm 处的OD值, 计算得出DNA 的含量。 如OD260 /OD280 = 1. 8 左右, DNA 较为纯净; 1. 8, 则 有蛋白污染; 1. 8, 则有RNA 污染。同时, 还可进一 步用1% 的琼脂糖电泳检测DNA 的质量, 以得到非常 直观的效果。图1是提取DNA样品的电泳图, 表明获 得的DNA 有较高的质量。 Tris-HCL：缓冲体系。提供稳定pH；NaCl：可以降低DNA在水中的溶解度，并且不破坏DNA的结构；EDTA: Ca2+ Mg2+ 的螯合剂，抑制DNase活性；SDS：使蛋白变性，促进蛋白质和DNA的分离；巯基乙醇：抗氧化剂，防止酚氧化成醌，保护DNA；也有人说可以用来消泡；醋酸钾：钾离子置换SDS的钠离子，形成不溶于水的PDS,将大量蛋白同步沉淀下来。氯仿：异戊醇：使蛋白变性。氯仿的作用是变性剂、抽提脂溶性物质；异戊醇作用是A.降低表面张力、阻止气泡的产生;B.有助于分相（使离心后水相、有机相稳定）（剧烈震荡时容易产生气泡，气泡会阻止相互间的充分作用）；异丙醇：沉淀DNA；70%乙醇：洗涤DNA；（盐、蛋白等溶于70%乙醇，而DNA不溶）100%乙醇：可以用于沉淀DNA，也可以用于使DNA快速干燥 1 氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚易溶于氯仿中）用酚-氯仿抽提细胞基因组DNA时，通常要在酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气泡。异戊醇可以降低表面张力，从而减少气泡产生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层含DNA的水相、中间的变性蛋白相及下层有机溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀DNA时，为什么加入单价的阳离子？用乙醇沉淀DNA时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的负电荷，减少DNA分子之间的同性电荷相斥力，而易于聚集沉淀。 2 DNA提取分为三个基本步骤 每个步骤的具体方法可根据样品种类、影响提取的物质以及后续步骤的不同而有区别。 .细胞的破碎 细菌有坚硬的细胞壁，首先要破碎经胞。方法有三种;①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法;②化学试剂法：用SDS处理细胞;③酶解法：加入溶菌酶或蜗牛酶，都可使细