重组腺病毒Ad5F35-SD-EGFP的构建及其对K562细胞增殖的影响.pdfVIP

· 1806 · 南方医科大学学报 (JSouthMedUniv) 2011；31(11) · 基础研究 · 重组腺病毒Ad5F35．SD—EGFP的构建及其对K562细胞增殖的 影响 史 静 ，胡 晶 ，肖青 ，彭 智 ，曹唯希 ，罗秋平 ，王 方 ，冯文莉 重庆医科大学 附属第一医院检验科，临床血液学教研 室，临床检验诊断学教育部重点实验室，血液科，重 庆 400016 摘要：目的 构建表达SH2一DED融合基因的新型重组腺病毒Ad5F35．SD．EGFP，观察其对K562细胞增殖的抑制作用。 方法 重叠PCR扩增SH2一DED融合基因并克隆至腺病毒穿梭载体pAdTrack．CMV中，构建成穿梭质粒pAdT-SD—EGFP 并进行酶切和测序鉴定。穿梭质粒经PmeI酶切后转化pAd5F35．GFP的BJ5183感受态，通过细菌内同源重组产生重组 腺病毒质粒pAd5F35．sD—EGFP及其突变体，PacI酶切后转染AD293细胞进行包装。重组腺病毒Ad5F35．sD—EGFP经 PCR和westernblot鉴定后进行病毒扩增和滴度测定。体外感染K562细胞 ，通过MTT和流式周期检测实验观察 Ad5F35．SDEGFP对K562细胞增殖的影响。结果 PCR、酶切和测序结果均表明pAdT-SD．EGFP和pAd5F35-SD—EGFP 构建成功；PCR、EGFP检测结果证明重组腺病毒Ad5F35一SD．EGFP包装扩增成功，滴度可达 1．4x10pfu／ml。转染K562 细胞后，Westernblot可检测到 目的蛋白的表达，MTT实验和流式周期检测结果证明其对K562细胞的增殖有明显的抑制 作用。结论 成功构建并鉴定了携带SH2．DED融合基因的重组腺病毒Ad5F35．SD-EGFP，其对BCR—ABL阳性K562细 胞的增殖有明显的抑制作用。 关键词：Bcr-Abl；SH2；DED；重组腺病毒；AD293细胞 中图分类号：Q78 文献标志码：A 文章编号：1673—4254(2011)11-1806-06 Construction ofarecombinantadenovirusAd5F35．．SD—-EGFP anditseffecton K562cell proliferation SHIling1，HUJinf，XIAOQing3,PENGZhi2,CAOWei—xi2,LUOQiu—pinf，WANGFang~，FENGWen—li2 DepartmentofClinicalLaboratory,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversifzDepartmentofClinicalHematology, KeyLaboratoryofLaboratoryMedicalofEducationMinistryofChina,。DepartmentofHematology,FirstAffiliatedHospitalof ChongqingMedicalUniversity,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016，China Abstract：ObiectiveToconstructarecombinantadenovirusvectorforSH2一DEDfusiongeneandassessitsinhibitory effectontheproliferationofK562cells．M ethodsSH2一DED fusiongeneanditsmutantSH2mt—DED wereamplified bysplicingPCRandclonedintopAdTrack—CMV plasmidseparatelytoconstructtheshuttleplasmidspAdT—SD—EGFP