实验四考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度.pdfVIP

实验四 蛋白质浓度的测定 -考马斯亮蓝G-250法 Exp. 4 Determination of Protein by the Coommassie Brilliant Blue G-250 一、实验原理  考马斯亮蓝G-250是一种染料，其磷酸溶液呈棕 红色，最大光吸收在465nm，当与蛋白质结合后呈 蓝色。在一定范围内，蛋白质-考马斯亮蓝G-250复 合物在595 nm下的吸光度与蛋白质含量成正比。 蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在几分钟的时间 内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温 下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试 剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏 度比Lowry 法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量， 测定蛋白质浓度范围为0～1000μg／ml ，是一种常 用的微量蛋白质快速测定方法。 Bradford法的突出优点是：  （1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很 高的消光系数，因此蛋白质测定的灵敏度较 高，最低检出量为1ug蛋白质。据估计比 Lowry法约高四倍， （2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结 合，大约只需2分钟，结合物的颜色在1小时 内是稳定的。因而完全不用像Lowry法那样费 时和严格地控制时间。 （3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、 Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、 巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。 此法的缺点是：  （1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的 含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有 较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用 γ—球蛋白 为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质 有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS） 和0.1M的NaOH，少量的去污剂可通过用适当的对照消 除，而必要时必须预先处理样品。 （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer 定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质 的浓度。 二、实验用品 1、材料 a.标准溶液：牛血清白蛋白 （BSA ） b.样品液：未知浓度的蛋白溶液 2、试剂 （1）0.9% NaCl溶液 （2 ）标准蛋白质溶液：0.1mg/ml BSA (0.9% NaCl溶液) 。 （3 ）0.01%考马斯亮蓝G-250染液：按实 验方法配制。 3、主要仪器 分光光度仪 三、方法和步骤 1. 标准曲线的制作 按下表进行编号并加入试剂。混匀，室温静置3min后， 以管1为空白对照，在595nm下比色测定。以各标准液浓 度(μg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 表1.牛血清白蛋白标准曲线的制作 试剂 管号 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白质液/ml — 0.1 0.2 0.3 0.4 0.6 0.8 0.9%NaCl溶液/ml 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.4 0.2 考马斯亮蓝染液/ml 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蛋白质含量/μg/ml 0 10 20 30 40 60 80 A 595 nm 2 ．样品 样品管3支：1ml样品液+考马斯亮蓝染液4.0ml （测定的光吸收 值