聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶.ppt

实验4、聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶 同工酶 影响电泳速度的外界因素 1.电场强度 电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每一厘米）支持物体上的电位降 一般，电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。 过高、过低均不宜 当需要增大电场强度以缩短电泳时间时，需附有冷却装置 2．缓冲液的pH值和离子强度 pH值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大 缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般所用离子强度为0.02-0.2之间。 3.电渗现象 液体在电场中对于一个固体支持物的相对移动，称为电渗现象。 电渗方向影响泳动速率 4、温度的影响 温度每升高1℃，迁移率约增加2.4%。为降低热效应对电泳的影响，可控制电压或电流，或在电泳系统中安装冷却散热装置。 5、支持物的影响 对支持物的要求一般是均匀和吸附力小，否则电场强度不均匀，影响区带的分离。 目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。 聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) 单体：丙烯酰胺（acrylamide，Acr） 交联剂：甲叉双丙烯酰胺（bisacrylamide，Bis） 催化系统 聚合作用只有在自由基存在时才能发生，需要一个催化诱发剂系统产生自由基 化学聚合 　过硫酸铵—TEMED（四甲基乙二胺） 　 光聚合 　核黄素—TEMED 　需要有痕量氧存在 ，直接日光或室内强散射光 凝胶孔径大小与凝胶浓度和交联度有关 １、电荷效应：各种蛋白质按其所带电荷的种类及数量，在电场向一定电极，以一定速度泳动。 ２、分子筛效应：凝胶浓度不同，网孔径大小不同。分子量和构型不同的蛋白质分子，通过一定孔径的凝胶时所受阻力不同，引起泳动速度的变化，从而达到分离目的。 ３、浓缩效应 目的要求 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。 实验原理 由于同工酶的酶蛋白分子大小和结构不同，携带的电荷种类和数量不同，所以可用凝胶电泳将它们一一分开。在适宜酶催化反应的条件下提供酶作用的底物，再利用特殊的显色反应以显示产物的形成或底物的消失，就可以看到经电泳分离后的同工酶谱带。 同工酶鉴定的一般步骤： 1.从植物样品中提出粗酶液。 2.聚丙烯酰胺凝胶电泳把样品中酶带分开。 3.用专一作用的底物和特殊染料把需要分析的酶染色，显示同工酶酶谱。 4.记录分析结果。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（vertical slab）型之分，但两者的原理完全相同。 垂直板形具有板薄，易冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，大多数实验室采用。 电泳装置 本实验采用不连续系统凝胶电泳，整个电泳系统包括DYY型常压电泳仪、夹心式垂直板电泳槽。 器材 见教材 操作方法 一、安装夹心式垂直板电泳槽 将两块玻璃板用海绵沾去污剂洗净，再用蒸馏水冲洗，干燥（勿用手指接触玻璃板面，可用手夹住玻璃板的两旁操作），然后正确放入硅胶条中，用pH8.9缓冲液配制的1.5％琼脂溶液封底，待琼脂凝固后夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝，安装好电泳槽，注意用力均衡以免夹碎玻璃板 二、制备凝胶板 将分离胶沿长玻璃板加入胶室内，小心不要产生气泡(加到一半时要在长玻璃端倒入电极缓冲液，以缓解压力，避免压破琼脂)，加至距短玻璃板顶端3cm处（提前作记号），立即覆盖2～3mm的水层（或水饱和正丁醇），静置待聚合（约40min），当胶与水层的界面重新出现时表明胶已聚合。 先倒掉分离胶上的水层（滤纸条吸掉），立即加入浓缩胶（约距短玻板上缘0.5cm的高度），插入梳子（即样品槽模板，注意：有棱一面朝向短玻板），待胶凝后（约40min），小心取出梳子，滤纸条吸干梳孔内的水分。将稀释10倍的电极缓冲液倒入两槽中，前槽（短板侧）缓冲液要求没过样品槽，后槽（长板侧）缓冲液要求没过电极，备用。 三、样品制备 称取材料4 g，放入研钵内，加pH 8.0提取液4 mL，于冰水浴中研成匀浆，然后以4 mL提取液分几次洗入离心管，在高速离心机上以8000r/min离心20min，倒出上清液（3ml，分装在两个小离心管内），以等量40％蔗糖（5-6ml加4克蔗糖）及1/5体积溴酚蓝（1-2滴）指示剂混和，留作点样用。 四、点样 用微量注射器取25μL上述混合液，通过缓冲液，小心的将样品加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。 五、电泳 将直流稳压电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接（方向切勿接错），打开电泳仪开关，开始时将电流调至15mA，待样品进入分离胶时，将电流条至25mA。当蓝色染料迁移至距离橡胶况下缘1cm时，将电