影响牛PCR胚胎性别鉴定雌性准确率的因素分析研究.pdfVIP

中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 影响牛PCR胚胎性别鉴定雌性准确率的因素分析 余文莉1’2崔利艳2李树静k2白音1 1、北京安伯胚胎生物技术中心 100107；2、河北农业大学动物科技学院071001 摘 要：本试验对影响牛性别鉴定雌性胚胎产犊准确率的因素进行了研究。结果表明：胚胎质量 对产犊准确率有显著影响。取样大于等于5个细胞组的产母犊准确率高于取样1-4个细胞组，二者 差异极显著。取样细胞活性对胚胎性别鉴定的准确率有显著影响。电泳条带清晰程度对性别鉴定准 确率有极显著影响，而胚胎发育阶段和取样时有无透明带对产犊牛准确率无显著影响。 关键词：牛；胚胎性别鉴定；准确率 以PCR为基础的牛早期胚胎性别鉴定技术是通过扩增Y染色体上的特异性片断SRY基因来检 测早期胚胎性别的一种技术。它以其速度快、鉴定比较准确等优点而越来越受到广大商业化胚胎生 物公司的青睐。但在该技术中仍存在着许多影响其准确率的因素，正是因为这些因素的存在而影响 了该技术的进一步推广。本文对胚胎质量、胚龄、取样大小和电泳图谱清晰程度等因素对PCR鉴定 结果为雌性的牛胚胎产犊准确率的影响进行分析，以减小这些因素对胚胎产犊准确率的影响，提高 胚胎性别鉴定的准确率，为该技术的进一步商业化推广奠定技术基础。 1．材料和方法 1．1材料 1．1．1胚胎取自超排发情后7-7．5天的高产荷斯坦奶牛。胚胎发育阶段：紧缩桑椹胚、早期囊胚、 囊胚和扩张囊胚。胚胎质量：1、2级。 1．1．2受体牛主要以黄牛作受体。 POLAROID照相系统、胚胎冷冻仪(CL一5500，Australian) DIcKINSoN 公司)、显微分割刀(AB WA)、2ul取样吸头和200ul通用吸头(AB Technology，Inc，Pullman u WA)、100 Technology,Inc，Pullman (RETRWAL，AB Technology)、 YCD扩增反应混合物、雌性和雄性扩增对照样品(AB Technology和自制) 1．2方法 冷冻前保存在HOLDING液中。 1．2．2胚胎取样将胚胎分割仪与倒置显微镜固定在一起，将显微分割刀固定在显微操作仪的操作手 5遍，将洗好的胚胎放入其中。胚胎被放大100倍进行分割取样。理想的情况下，在桑椹胚的边缘或 囊胚的滋养层切取由6—10个细胞组成的小块。每个胚胎取样后，分割刀依次在纯水、95％乙醇、纯水、 u 起，推入装有8ul超纯水的1001离心管中。样品取走后，用200ul通用吸头吸取50ul回收液，从分 割液滴中将取样后的胚胎吸起，放入6孔平皿对应的HOLDING液滴中准备移植或冷冻。 1．2～PCR反应在每个加有样品的离心管中依次加入8．5ulYCD，然后将其摆放在PCR反应槽中， 变性温度95。C，延伸温度72℃，退火温度64。C，经过30个循环65min进行DNA扩增。 35 中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三届学术研讨会论文集 压的琼脂糖凝胶板上运行15-20min。 1．2．5结果分析如样品出现三条电泳带，即雌雄共有的常染色体基因片段、Y一染色体上相应片段 和“引物带”的胚胎即为雄性胚胎，只出现共有基因片段和“引物带”的胚胎即为雌性胚胎。判定 结果分为三类： 1)鉴定结果明显：雌或雄结果明显，无任何污染条带。 2)鉴定结果弱：带较暗；带与带之间模糊，外源DNA污染：雌性被雄性污染。 3)没反应：只有引物带或无带。 常规冷冻。冷冻程序：．6℃，5分钟，植冰，5分钟，0．5℃／分钟降温至．35℃投入液氮。 1．2．7胚胎解冻将雌性胚胎从液氮中取出直接放入32．35C水浴中10秒，将细管外的水迹拭干， 将胚胎直接推入HOLDING液中洗3—4次，采用四段式将胚胎吸入0．25ml塑料细管内移植