两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒.pdfVIP

一48一 江苏农业科学2010年第5期 郭全海，陈 陆，王川庆，等．两步化学转化法构建猪圆环病毒2型ORF2基因重组腺病毒质粒[J]．江苏农业科学，20LO(5)：48—50 两步化学转化法构建猪圆环病毒2型 ORF2基因重组腺病毒质粒 郭全海1’2’3，陈陆1，Y-)lI庆1，吴德峰3，李志娟1，王永生1，刘扬科1 (1．河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；2．商丘职业技术学院，河南商丘476000； 3．福建农林大学，福建福州350002) 摘要：为了利用化学转化法快速构建携带猪圆环病毒2型ORF2基因的重组腺病毒质粒以便获得表达该基因的 重组腺病毒，首先把骨架质粒pAde部y一1通过化学法转化到氯化钙法制备的E．coilBJ5183感受态菌中，通过含氨苄 青霉素的LB平板筛选出含骨架质粒的阳性菌BJ5183／p，再次用化学法把插入有猪圆环病毒2型ORF2基因的穿梭质 粒rpShuttle—CMV一276经PmeI酶切线性化后转化到BJ5183／p感受态细胞中进行同源重组，再在含卡那霉素的LB 平板上培养．筛选出卡那霉素抗性菌进行质粒抽提纯化，酶切并电泳鉴定，获得重组阳性质粒rPAD一276。结果表明， 运用2步化学转化法构建重组腺病毒质粒是一种简便、快捷且容易操作的方法。 关键词：化学转化法；猪圆环病毒2型ORF2基因；重组；腺病毒质粒；构建 中图分类号：Q784文献标志码：A 文章编号：1002一1302【20lO)05—0048—03 人5型腺病毒载体属于复制缺陷型载体，由于该载体有 1材料与方法 许多优点，目前已经成为应用最广泛的载体之一【l。】。腺病 毒载体的穿梭质粒和骨架质粒有同源序列，两者在重组酶的 1．1材料 作用下进行同源重组构建成霞组腺病毒质粒。构建重组腺病 毒的方法有许多种H。，最早是加拿大Gramham小组建立了在 真核细胞内通过骨架质粒和穿梭质粒的同源重组构建出腺病 赠，PCv2病毒及PK—15细胞由河南农业大学传染病实验室 毒”1。由于2种质粒需要共转染到293A细胞内，所以转染保存。 I酶、Hind 的效率比较低，同源重组的效率也非常低，最后，包装出腺病 1．1．2主要试剂及仪器rraqDNA聚合酶、K4,n DNA Ladder Ⅲ酶、dNTP、蛋白酶K、DL2000Marker、250 毒就有一定的难度，而且很难避免污染。1998年，He等首次 bp Marker和k／HindIIIMarker购于宝生物工程(大连)有限公 报道将线性化的穿梭质粒和骨架质粒转化到BJ5183感受态 菌中并在菌体内实现同源重组，先构建出重组腺病毒质粒，进 司；PacI酶和PmeI酶购于NEB公司；DNA胶回收试剂盒购 而获得腺病毒一1。该方法的同源重组是在原核细胞内完成 于北京百泰克生物技术有限公司、台式高速低温离心机(Uni· 的，与真核细胞内同源重组相比，操作简便，降低了试验难度。 versal 可该方法需要使用电转化仪把骨架质粒和穿梭质粒同时转化 型)为东胜创新生物科技有限公司产品；ZS一2200型凝胶成 到BJ5183工程菌中，而且，对感受态细胞的质量要求也很高，像系统为美国Alpha公司产品。 所以对试验要求仍较高。zerIg等又对此构建方法进行改进，1．2方法 1．2．1PCv2 应用电穿孔法先将骨架质粒pAdE鹪y—l导入BJ5183细菌， DNA的提取PCV2病毒的增殖参照文献[8]