实验二改良微量凯氏定氮法测定血清蛋白质总量 - 遵义医学院临床 .ppt

蛋白质是机体内主要的含氮化合物，血清中含有蛋白质，也含有少量的非蛋白质含氮化合物。 根据蛋白质中氮元素含量相当恒定（一般平均为16％）这一特点即可得到血清蛋白质含量。 1、无蛋白滤液的制备 2、稀释血清的制备(由教师准备，学生无需操作) 3、消化 4、显色 计算公式： (1)每100ml血清总含氮量:（单位：g N/100ml） C测=A测/A标×C标×稀释倍数 (2)每100ml血清非蛋白含氮量：（单位：g N/100ml） CNPN=ANPN/A标×C标×稀释倍数 (3)每100ml血清蛋白含氮量：（单位：g N/100ml） Cpro= C测 － CNPN (4) 血清蛋白质含量： （单位：g/100ml） Cpro×6.25 1、过滤无蛋白滤液前，滤纸是否可以预先湿润？为什么要制备无蛋白滤液？ 2、无蛋白滤液如果不是无色透明，说明可能存在什么问题？ 3、稀释血清及无蛋白滤液消化显色后所测的含氮量有何区别？ 4、除采用微量凯氏定氮法测定蛋白质含量以外？还可以利用哪些方法测定其含量，分别利用了蛋白质的什么性质。能否举出一、两种方法？ 实验三 血清蛋白醋酸纤维素薄膜电泳 补 充 内 容 一、微量凯氏定氮法测定蛋白质 （1）消化：样品与硫酸一起加热消化，硫酸使有机物脱水。并破坏有机物，使有机物中的C、H氧化为CO2和H2O蒸汽逸出，而pro则分解氮，则与硫酸结合成硫酸铵，留在酸性溶液中。 （2）显色、比色：硫酸氨与碱性的纳氏试剂作用生成棕色胶体溶液。同样处理标准硫酸氨溶液比色。 （3）除去NPN的影响。 （4）利用钨酸使蛋白质变性的原理制备无蛋白质滤液。 （5）血清总氮量－NPN，根据蛋白质含氮量通常在16 %左右，所以将凯氏定氮法测得的含氮量乘上系数6.25，便得到该样品的蛋白质含量。 灵敏度低，适用于0.2～1.0mg氮，误差为±2％费时。 二、双缩脲法（ Biuret法） H2N-CO-NH2 + NH2-CO-NH2→ H2N-CO-NH-CO-NH2 ＋NH3 双缩脲 双缩脲反应：双缩脲在碱性条件下与铜离子结合生成紫红色化合物，颜色深浅与蛋白质浓度成正比。 本法测定蛋白质范围1-20mg 三、Folin-酚试剂法(Lowry法)测定蛋白质浓度 蛋白质含有两个以上的肽键(—CO—NH—)，因此有双缩脲反应，在碱性溶液中，能与Cu2+形成络合物。Folin酚反应是在双缩脲反应的基础上，引进Folin试剂(磷钼酸—磷钨酸试剂)，蛋白质—铜络合物能还原磷钼酸—磷钨酸试剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质的量成正比例。 优点：是操作简便、灵敏度高、较紫外吸收法灵敏10－20倍，较双缩脲法灵敏100倍。 缺点：其不足之处是此反应受多种因素干扰。 四、紫外分光光度法测定蛋白质浓度 由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280 nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值(OD280)与其含量呈正比关系，可用作定量测定。 利用紫外吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。 五、考马斯亮蓝染色法测定蛋白质浓度 考马斯亮蓝在一定蛋白质浓度范围内，蛋白质和染料结合符合比尔定律 ，因此可以通过测定染料在595nm处光吸收的增加量得到与其结合的蛋白质量。该法简单、迅速、干扰物质少、灵敏度高（比Lowry法灵敏4倍）。 六、 BCA（Bicinchoninic acid，二辛可宁酸、二羧基二喹啉） 原理：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 BCA的优点 准确灵敏：BCA试剂的蛋白质测定范围是20－2000μg/ml；Micro BCA试剂测定范围是0.5-20μg/ml 快速：45分钟内完成测定，比经典的Lowry法快4倍而且更加方便 经济实用：除试管外，测定可在微孔板中进行，大大节约样品和试剂用量 不受样品中离子型和非离子型去污剂影响 检测不同蛋白质分子的变异系数小于考马斯亮蓝 生物化学教研室 朱欣婷 实验二 改良的微量凯氏定氮法测定血清蛋白质含量 前 言 蛋白质含量测定法，是生物化学研究中最常用、最基