聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究.PDFVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１３，３３（６）：１２１７ 聚乙二醇修饰重组溶葡球菌酶的初步研究 １ ２ １ ２ ２ ２ １ 王　永 　刘沐荣 　万海同　刘　翔 　张加慧 　封小燕 　张　钒 （１浙江中医药大学生物工程学院　杭州　３１００５３　２杭州北斗生物技术有限公司　杭州　３１００１１） 摘要　目的：探讨聚乙二醇（ＰＥＧ）修饰重组溶葡球菌酶（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）的反应条件以及修饰后产物 的纯化方法。方法：采用超声波细胞粉碎机进行菌体破碎，阳离子交换层析、疏水层析进行蛋白 纯化；在不同条件下，将活化的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯（ｍＰＥＧＳＰＡ）与纯化后的 ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ反应，以单个ＰＥＧＬｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ的比例为指标，用ＳＤＳＰＡＧＥ、ＭＡＬＤＩＴＯＦＭＳ方法确定 其在修饰产物中的所占比例；采用ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００分子筛凝胶层析法对修饰产物进行分离纯化。 结果：ｍＰＥＧＳＰＡ修饰ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ的反应条件为ｐＨ８．０，温度４℃，ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ与ｍＰＥＧＳＰＡ的质 量比为１∶５，反应时间２．０ｈ；反应产物经一步ＳｅｐｈａｃｒｙｌＳ２００分子筛凝胶层析纯化后，初步实现分 离。结论：初步确定了聚乙二醇修饰ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ的反应条件及修饰产物的纯化方法。 关键词　聚乙二醇　重组溶葡球菌酶　纯化　单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯 中图分类号　Ｑ８１９ ［１］ 　　溶葡球菌酶（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）由Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ等 于１９６４ １　材料与方法 年首次从一株编号为 ＮＲＲＬＢ２６２８的模仿葡萄球菌 （Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓｓｉｍｕｌａｎｓ）培养物中发现并分离。此酶 １．１　材　料 为２４６个氨基酸组成的单链分子，分子量２７ｋＤａ，等电 １．１．１　 试 剂 　 ＭＳＰＡ（Ｍ．Ｗ．５０００）（Ｊｅｋｅｍ 点ＰＩ介于１０．４～１１．４之间，其中锌为必须的辅助因 Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）；胰蛋白胨和酵母粉（ＯＸＯＩＤ公司）；Ａｍｐ ［２４］ 子 。它能特异性水解细菌细胞壁肽聚糖交联结构 （氨苄青霉素）（华北制药股份有限公司）；ＩＰＴＧ（异丙 甘氨酸五肽桥联中第２位和第 ３位甘氨酸形成的肽 基硫代Ｄ半乳糖苷）、ＳＤＳ（北京鼎国昌盛生物科技 β ［５］ 键 ，因此具有破壁溶菌的作用。由于甘氨酸五肽桥 有限责任公司）；牛血清白蛋白（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ公司）；其 联结构仅大量存在于葡萄球菌细胞壁中，其中又以金 余试剂均为分析纯或生化纯试剂。 葡菌细胞壁分布最广，因此ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ主要对葡萄球菌 １．１．２　菌株　含有 ｐＥＴ２２ｂｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ表达质粒的 ［６］ 尤其是金黄色葡萄球菌具有杀菌溶菌作用 。然而 ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌 ＢＬ２１ ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ作为一种体外抗菌药物，固体状态保存时往 （均为本实验室保存）。 往不利于应用，液体状态存储时稳定性则比较差。为 １．１．３　仪器　立式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申 了提高溶葡球菌酶的热稳定性，我们拟通过ＰＥＧ修饰 安医疗器械厂）；超声波细胞粉碎机（宁波荣顺科技仪 技术对溶葡球菌酶进行多点修饰。为此，本文进行了 器厂）；ＢＥＣＫＭＡＮ高速冷冻离心机（德国ＢＥＣＫＭＡＮ）； 溶葡球菌酶的制备、纯化，修饰条件筛选，修饰产物的 ＡＫＴＡ ｐｒｉｍｅ （Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｃｓｃｉｅｎｃｅｓ公 司）；ＳＰ 分离纯化以及热稳定性考察等研究。