包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程.docx

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决包涵体的纯化和复性总结包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤：包涵体的洗涤包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所 以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。包涵体的溶解变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基 苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形 成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。常用变性剂对比尿素（8-10M）较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化盐酸胍（6-8M）溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀对蛋白质离子交换色谱有干扰包涵体的复性复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过 程开始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：复性技术简介优点缺点稀释复性用折叠缓冲液快速稀释溶解的包涵体蛋白质溶液，达到降低变性剂浓度的目的，使去折叠的蛋白质进行再折叠简单慢蛋白会被稀释到很低浓度体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制透析复性通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度简单不增加体积慢使用大量缓冲液不适合大规模操作，无法应用到生产规模分子筛层析分子筛效应可将蛋白质和小分子变性剂分离，实现溶液交换和蛋白质的折叠在一步操作中直接进行自动化复性并纯化样品体积受限离子交换层析减少导致蛋白质聚集的分子间相互作用，可将蛋白质结合在分离介质上，达到溶液中变性剂浓度的稀释和蛋白质的折叠快速并简单直接进行自动化应避免使用与离子交换自相反电荷的添加复性的检测根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。蛋白复性过程的添加剂共溶剂：如PEG6000-20000，据说可以可逆的修饰折叠中间体的疏水集团，此外由于阻止了蛋白质分子间的相互接触的机会，也可能对复性效率的提高起作用。一般的使用浓度在0.1%左右，具体条件可根据实验条件确定。二硫键异构酶（PDI）和脯氨酸异构酶（PPI）：PDI可以使错配的二硫键打开并重新组合，从而有利于恢复到正常的结构，此外在复性过程中蛋白 质的脯氨酸两种构象间的转变需要较高能量，常常是复性过程中的限速步骤，而PPI的作用是促进两种构象间的转变，从而促进复性的进行。分子伴侣，即热休克