分子生物学大实验-生科环境专业.ppt

2010级生物科学专业 2012.9 分子生物学大实验 课程特点 时间长，集中，强度较大； 操作要求高，涉及的基本操作技能技巧较多； 实验中将接触一些有毒试剂（如E.B.和氯仿）。 课程要求 掌握实验原理，实践、熟悉并规范分子生物学主要的技术操作，学习药品及培养基配制方法。 实验前充分做好预习和各种准备，熟悉实验指导中的实验操作过程，准备一个实验记录本； 穿实验服，实验操作认真仔细，小心有毒药品的使用； 组内做好安排和协调，相互协作，互相谦让； 遵守时间，遵守纪律，不在实验室内大声喧哗，不做与实验无关的事情。 分子生物学主要技术 DNA、RNA的提取 质粒DNA的提取 感受态细胞的制备及质粒DNA重组、转化和筛选 DNA酶切 PCR 核酸及蛋白质杂交 1、质粒DNA的提取及其酶切检测 质粒DNA提取技术（碱裂解法） 限制性内切酶酶切技术 电泳技术（琼脂糖凝胶电泳） 2、聚合酶链式反应（PCR） 反应体系的构建 反应程序的设计 扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测 实验内容 质粒DNA的提取及其酶切检测 质粒(plasmid)是存在于细菌染色体外的小的共价、闭环双链DNA分子，能自主复制，并在细胞分裂时遗传给子代细胞。质粒可赋予宿主细胞一些遗传性状如抗药性等，通过质粒赋予细菌的表型可识别质粒的存在，这是筛选重组转化子的基础。 质粒复制和转录或多或少依赖于宿主编码的酶和蛋白质。 质粒分为严紧型和松弛型，我们现在使用的许多质粒（如PUC系列）多属松弛型质粒，能复制到很高的拷贝数，只要将培养物放在合适的培养基中生长到对数晚期，就可以用于质粒提取。 掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理； 掌握质粒DNA的中小量提取方法； 掌握限制性核酸内切酶酶切DNA的原理和方法； 掌握质粒DNA酶切分析的方法。 实验目的 实验原理 本实验利用碱裂解法中量提取质粒DNA。在NaOH/SDS等作用下，细菌细胞壁遭到破坏，使DNA从细菌中释放出来。在碱性条件下，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，将pH值调至中性，并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构，大部分DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA由于处于拓扑缠绕状态，能够迅速重新形成可溶性分子。通过离心，可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，而质粒DNA仍留在上清中，用异丙醇或乙醇沉淀可将之纯化出来。 限制性核酸内切酶是基因工程中最常用的工具酶。其作用特点是特异识别DNA分子中的碱基序列（一般为4-6个碱基对的反向重复序列），酶切后产生平齐末端或粘性末端。 本实验采用EcoRI酶切提取的质粒pUC19。 克隆载体pUC19质粒图谱 试剂 LB液体培养基 STE溶液：0.1mol/LNaCl，10mmol/LTris.Cl，1mmol/LEDTA pH8.0 溶液I：50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris.Cl，10mmol/LEDTA pH8.0 溶液II：0.2mol/LNaOH，1%SDS，现用现配（0.4mol/LNaOH和2%SDS 等量混合）。 溶液III：5mol/L乙酸钾60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml 氯仿：异戊醇=24：1 无水乙醇 70%乙醇 10×限制酶缓冲液 限制酶EcoRI pUC19 实验方法 仪器设备 恒温摇床、水浴锅、台式高速离心机、微量加样器、超净工作台 琼脂糖凝胶电泳试剂和仪器见其实验 1、从选择性培养基平板上挑取单菌落，移至含有相应抗生素的10mlLB液体培养基中，于37℃振荡培养过夜。 2、将培养物转移到一个15mL的试管中，4000rpm离心10min。 3、弃上清，将细菌沉淀重悬于1mlSTE溶液中，剧烈振荡，充分悬浮，将悬浮液转移到1.5ml离心管中， 8000rpm离心5min。 。 4、弃上清，将细菌沉淀重悬于200ul预冷的溶液I中，剧烈振荡，充分悬浮。 5、加400ul新配制的溶液II到悬液中，盖紧管口，快速颠倒离心管数次，混合内容物，将离心管置于冰上。 6、加300ul预冷的碱裂解液III，盖紧管口，反复颠倒数次，使之在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，然后将离心管置于冰上3-5min。 实验步骤 7、8000-10000rpm，4℃离心5min，转移上清（约600ul）到一新的离心管中。 8、加等体积的氯仿（酚：氯仿），通过剧烈振荡混合有机相和水相，8000-10000rpm，4℃离心2min，转移上清到另一离心管中。 9、室温下加入600ul异丙醇以从上清中沉淀核酸，剧烈振动混合液，于室温下放置2min。 10、 8000-10000rpm，离心5min，收集核酸沉淀。 11、小心弃上清，将离心管倒置于吸水纸上，将液体吸干，加1ml70%乙醇洗涤沉淀。 12、 8000-10